[发明专利]一种高效率的基因编辑方法

说明书

本发明涉及一种高效率的基因编辑方法。揭示了一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法──同源介导的末端接合法(HMEJ)。本发明所述的HMEJ方法，利用带有单个向导RNA靶向位点和长同源臂的供体构建物，可实现精确的基因编辑，且基因编辑效率高。

技术领域

本发明分子生物学领域，更具体地，本发明涉及一种高效率的基因编辑方法。

背景技术

本领域中，转基因中的定向整合通常采用的是同源重组(HomologousRecombination，HR)的方法。该方法需要一条含左右同源臂的修复模板，这样可以使得大DNA片段精确插入。订制化设计的核酸酶(CDNs)例如锌指核糖核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白-9核酸酶(Cas9)系统通过在基因组上定向形成DNA双链断裂(DSB)的方式极大地促进了转基因定向整合。一旦产生一个DSB，在细胞内部通过同源重组来进行修复时，外源的DNA片段会被引入该断裂位置的周围。然而，这种方法在动物胚胎和体内的效率通常很低，因为HR只在晚期S/G2期才激活。

非同源末端接合(Non-Homologous End Joining，NHEJ)是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活，实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ机制会将其连入双链断裂DSB位点，从而实现定点的基因敲入。

微同源臂介导的末端接合(Microhomology-Mediated End Joining，MMEJ)是一种利用5-25bp的微同源序列来介导易错配的末端连接的DNA双链断裂修复机制。在细胞周期中，不同于同源重组，MMEJ修复是在G1/早S期活跃。

最近报道，NHEJ或者MMEJ介导的方法能够做到大的外源DNA可高效插入基因组内。在这些方法中，靶向基因组位点和带有非同源臂或微同源臂(5～25bp)的供体载体同时被可控的核酸酶切割，然后通过NHEJ或者MMEJ方式将两者互相连接在一起，从而产生定向转基因整合。但是，NHEJ为基础的定向整合方式在整合位点会形成随机方向插入，在接合处也会引入多种插入缺失突变，这个特点使得很难将内外源基因同框整合融合成嵌合体蛋白。而MMEJ为基础的定向整合在培养的细胞中发生效率低。

因此，本领域还亟需提供新的或改进的转基因中的定向整合技术，以克服上述技术的一些缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效率的基因编辑方法，以及该高效率的基因编辑方法的应用，例如在基因治疗方面的应用。

在本发明的第一方面，提供一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法，所述方法包括：

(1)提供供体构建物，该构建物依次(5’→3’)包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；

(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对细胞基因组进行基因编辑。

在一个优选例中，所述的细胞包括但不限于：分裂细胞，非分裂细胞，体组织细胞。

在另一优选例中，所述的细胞包括但不限于：受精卵细，胞神经细胞(如神经元细胞，星型胶质细胞等)，瘤细胞(如神经瘤细胞等)，干细胞(如胚胎干细胞，骨髓干细胞等)，肝细胞。

在本发明的另一方面，提供一种制备基因组发生定向基因编辑的动物的方法，所述方法包括：