[发明专利]一种高效率的基因编辑方法

权利要求书

1.一种对细胞基因组进行定向基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供供体构建物，该构建物依次包括：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；

其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；

其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；

(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对细胞基因组进行基因编辑。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括：分裂细胞，非分裂细胞，体组织细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括：受精卵细，胞神经细胞，瘤细胞，干细胞，肝细胞。

4.一种制备基因组发生定向基因编辑的动物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供供体构建物，该构建物依次含有：sgRNA靶向序列1，5’同源臂，基因操作序列，3’同源臂，sgRNA靶向序列2；

其中，5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的不小于200bp的序列互补；

其中，所述的基因操作序列是用于对细胞基因组的待编辑基因区域进行改造的序列；

(2)以(1)的构建物作为供体，以靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA切割细胞基因组的待编辑基因区域，以靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA分别切割sgRNA靶向序列1和sgRNA靶向序列2，通过CRISPR/Cas9方法对动物受精卵进行基因编辑；

(3)使(2)的动物受精卵发育，获得基因组的待编辑基因区域发生精确编辑的动物。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的5’同源臂与3’同源臂分别与细胞基因组的待编辑基因区域两端的300～3000bp的序列互补。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的动物为哺乳动物，包括：人，非人灵长类动物，鼠，家畜。

7.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将(1)的供体构建物，靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物、靶向于sgRNA靶向序列1或能形成该sgRNA的构建物、靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA或能形成该sgRNA的构建物，以及Cas9mRNA或能形成Cas9蛋白的构建物共转入细胞中。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，能形成靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA的构建物，能形成靶向于sgRNA靶向序列1的sgRNA的构建物，能形成靶向于sgRNA靶向序列2的sgRNA的构建物，能形成Cas9蛋白的构建物位于1、2或多个表达载体上。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向于细胞基因组的待编辑基因区域的sgRNA、sgRNA靶向序列1的sgRNA、靶向于sgRNA靶向序列2是相同的sgRNA或不同的sgRNA。

10.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的基因编辑包括：针对细胞基因组的待编辑基因区域，进行：外源基因插入，基因片段删除，点突变，基因片段替换，基因修饰。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的外源基因插入包括：将外源基因设置于(1)的基因操作序列中，从而当将该基因操作序列被替换入细胞基因组后，该外源基因被定向地插入到细胞基因组中。