[发明专利]一种磁性凝集素载体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于全细胞固定化领域，涉及一种磁性凝集素载体的制备及用于细菌的快速固定化。

背景技术

ConA是一种植物血球凝集素，其本质是一类多价的、非免疫来源的、对糖及其缀合物高度专一识别的蛋白质。ConA最初用于免疫学研究，随着ConA纯化方法的发展及性质研究的日益深入，ConA应用的范围亦越来越广。除应用于临床诊断、治疗外,ConA已成为化学、生物化学、生物学、免疫学及医学等领域中有用的研究工具。Ana Cecilia Alves(参见：Ana.C.A.et al,2015)利用壳聚糖珠固定化凝集素制备成一种血管舒张剂；Oriol Penin(参见：Oriol.P.et al,2014)将凝集素固定在多晶硅表面用于细胞探测；Pan yiting(参见：Pan e t al,2015)将固定凝集素于聚合物上用以糖蛋白的富集；Alex Monzo(参见：Alex et al,2007)固定化凝集素于琼脂糖和二氧化硅表面用于富集糖聚合物。

细菌是一种重要的生物催化剂，已经广泛应用于药品、药物中间体和食品的制备、污水和大气处理、化工轻工产品等工业生产中(参见：de Carvalho,2011)。但游离细胞在培养基或者反应溶液中不稳定，不易连续使用，且对反应环境有较高的要求(参见：Dubey et al.,2013)。通过固定化获得稳定的固定化细胞，则可实现重复使用，且在生物反应器中可获得极高的菌体浓度，降低使用成本，容易回收，操作简单(参见：Anisha and Prema,2008；Leonard et al.,2011)。对于重组菌而言，采用固定化细胞，无需将酶分离纯化后再进行固定化，且胞内有辅因子再生所需的各种氧化还原酶类，对于氧化还原酶而言，无需添加辅因子，大大降低生物催化剂制备的成本(参见：Liet al.,2013；Zajkoska et al.,2013)。目前，很多国内外的学者在固定化细菌这一方面进行了研究尝试。例如，华东理工大学的倪克奉(参见：Kefeng Ni et al,2012)制备了一种生物仿生粘附材料原位固定化氧化葡萄糖酸杆菌；Gustav Rehn(参见：Gustav R.et al,2013)等利用壳聚糖的絮凝作用固定化重组大肠杆菌；Nadia Touisui(参见：Nadia T.et al,2013)制备了一种镁铝双氢氧化物固定化重组大肠杆菌。基于以上背景，本发明拟制备一种磁性凝集素载体，通过磁性纳米材料表面大量的醌基等功能基团与凝集素的氨基共价结合，制备这一磁性载体。利用凝集素对细胞的凝集作用固定化重组大肠杆菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速固定化重组大肠杆菌的方法，以达到大大缩短固定化时间，这一固定化方法适用范围广，不影响细胞的生物催化功能，传质阻力小，且制备的固定化细胞容易回收利用。

本发明的另一目的是提供这种用于快速固定化的载体的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)将FeSO₄·4H₂O和FeCl₃·6H₂O按照摩尔比1:1～1:5溶于蒸馏水中，然后转移至三颈圆底烧瓶中，在40～80℃，搅拌和氮气保护条件下，迅速加入10-40％的NH₄OH调节溶液至碱性，反应5-20min后，加入油酸，再搅拌反应25-50min后，获得的黑色沉淀用无水乙醇和超纯水反复清洗至上清液无色透明，强磁铁沉淀分离，于真空烘箱中烘干，得到油酸磁性纳米颗粒称为Fe₃O₄@OA；

(2)称取一定量的多巴胺盐酸盐溶解于缓冲溶液中，配制成1～10mg/mL的多巴胺盐酸溶液，将步骤(1)制备的油酸磁性纳米颗粒研磨均匀加入到多巴胺盐酸溶液中，超声10～50min，然后置空气中搅拌7～12h，搅拌结束后，用磁铁分离，获得的深棕色沉淀用乙醇和蒸馏水清洗，于真空烘箱中50℃烘干，得到磁性纳米颗粒称为多巴胺功能化磁性纳米载体，记为Fe₃O₄@OA@DP；

(3)将刀豆凝集素conA溶解于结合缓冲溶液中，得到一定浓度的刀豆凝集素conA储备液，取一定浓度的储备液，加入到步骤(2)中制备的Fe₃O₄@OA@DP纳米粒子中进行反应，反应结束后离心除去上清液，得到Fe₃O₄@OA@DP@conA磁性载体。