[发明专利]一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法

说明书

本发明涉及一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其包括如下步骤：1）小麦转接及液体培养：将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，在白天25‑28℃、光照16 h，夜间15‑20℃、黑暗条件下，于水平摇床上20‑50 rmp培养24‑48 h，然后添加1‑3 ml菌悬液，再继续培养5‑10天；2）小麦根系定殖细菌数量计数：取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2 ml 1×PBS缓冲液，研磨至浆状，采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。本发明方法在无菌环境下液体震荡培养，培养条件稳定可控，取样方法标准统一。

技术领域

本发明属于植物根系定殖测定技术领域，具体涉及一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法。

背景技术

植物促生根际细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是能够在植物根际定殖，提高植物营养的可给性、抑制病原菌的生长或产生某些特殊的促生物质，促进植物种子萌发和植物生长、发育的一类细菌。大量研究表明，使用PGPR菌肥，能够减少化肥用量20%-30%，减少农药用量30%以上，农作物增产10%-80%，在发展可持续农业中的作用越来越受到重视。

检测PGPR在根际定殖的方法，常用的是固态基质法。用土壤、草炭或蛭石等固态基质（灭菌或未灭菌）栽培植物，接种待测菌剂，培养一段时间后，取植物根系，平板计数或显微观察细菌在根际的定殖情况。固态基质法检测PGPR在根际定殖的影响因素较多，具体包括不同实验室所用基质差异较大，基质和空气中其他微生物的影响，基质含水量难以稳定控制，浇水会造成菌体的淋失，根际土取样方法不易统一等，导致实验的可重复性差，不同实验室之间获得的数据难以比较。因此，亟待研究新的检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，该方法在无菌环境下液体震荡培养，培养条件稳定可控，取样方法标准统一。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其包括如下步骤：

1）小麦转接及液体培养：将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体MS培养基中，在白天25-28℃、光照16 h，夜间15-20℃、黑暗条件下，于水平摇床上20-50 rmp培养24-48h，然后添加1-3 ml菌悬液，再继续培养5-10天；

2）小麦根系定殖细菌数量计数：取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2 ml 1×PBS缓冲液，研磨至浆状，采用LB固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。

具体的，步骤1）中，在固体培养基中培养的小麦苗经下述步骤获得：固体MS培养基分装于100-500 ml的组织培养瓶中，每瓶分装20-100 ml，110-121℃高压灭菌10-30 min；在超净工作台中，将催芽后的小麦种子播种于固体MS培养基表面，每瓶播种5-10粒种子；然后将播种后的组织培养瓶在白天25-28℃、光照16 h，夜间15-20℃、黑暗的条件下培养至小麦株高5-8 cm（约需培养5-10天）。

具体的，步骤1）中，菌悬液经下述步骤获得：30 ml规格的试管中装TSB液体培养基5 -10ml，110-121℃灭菌10-30 min；接入1环恶臭假单胞菌UW4菌苔，28-37℃、200-260 rmp培养12-24 h，离心收集菌体，菌体用液体MS培养基洗涤，然后用液体MS培养基悬浮并调至OD₆₀₀值为1即得。

和现有技术相比，本发明的有益效果：