[发明专利]带鱼抗氧化肽分离纯化方法

权利要求书

1.带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于以下步骤：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，在去腥液中浸泡去腥，脱脂；

2）酶解：采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶双步酶解，过滤得到带鱼抗氧化活性肽酶解液；

3）超滤：将步骤2得到的酶解液超滤，得到滤过液，干燥；

4）QFF阴离子交换层析：在QFF中加入超纯水，抽气，装柱，平衡，用Tris缓冲液和NaCl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，检测吸光度，干燥；

5）凝胶色谱层析：用蒸馏水浸泡凝胶，抽真空，装柱，平衡，用超纯水作为流动相，继续纯化分离QFF纯化后的活性肽粉末，收集洗脱液，检测吸光度，干燥；

6）高效液相色谱层析：将凝胶色谱层析纯化分离后的活性肽粉末采用高效液相色谱仪继续分离纯化，用乙腈和纯水进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋蒸得到高纯度带鱼抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤3中超滤膜规格为900~1200Da，压力为0.6~1.2pa。

3.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤4中在QFF中加入超纯水，缓慢倒入抽滤瓶中，连接抽滤机，抽干其中的气泡，在抽气的过程中，置换蒸馏水，抽气完毕后，将QFF溶液沿着玻璃漏斗缓慢装柱，待装柱完毕静置20~40min后，用5~6倍装柱体积，pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L的Tris-HCl缓冲液进行平衡。

4.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤4中梯度洗脱液依次为Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.5mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠，Tris-HCl缓冲液pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L。

5.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤4中流速为2.5~3.5 ml/min，每18~23s收集一管洗脱液，于220nm和280nm处检测吸光值。

6.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤5中凝胶常温浸泡20~26h，充分溶胀后吸去上层悬浮的胶粒，倒入抽滤瓶中，抽真空。

7.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤5中灌胶前，先注入1/5~1/3柱体积的超纯水，沿壁连续缓慢注入凝胶，吸耳球轻击层析柱，以1.6~2.3倍量柱体积的超纯水平衡柱子。

8.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤5中流速为1.6~2.4 ml/min，每1.6~2.3min收集一管，于280nm处检测紫外吸收值。

9.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤6中采用梯度洗脱，洗脱时间、洗脱液成份及其百分比和流速依次为：0~5min，乙腈5%，纯水95%，流速0.5~0.7 ml/min；5~10min，乙腈10%，纯水90%，流速0.5~0.7 ml/min；10~20min，乙腈60%，纯水40%，流速0.7~0.9 ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.7~0.9 ml/min；30~40min，乙腈60%，纯水40%，流速0.5~0.7 ml/min；40~50min，乙腈20%，纯水80%，流速0.7~0.9 ml/min。

10.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的带鱼抗氧化肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFCGTASCTHYLCRVLHPGKLCVCVNCSR。