[发明专利]一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种丙型肝炎病毒（HCV）检测试剂盒，特别涉及一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒（(Hepatitis C Virus，HCV）属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA病毒，易变异，目前可分为6个基因型及50多种不同亚型。HCV体呈球形，其直径小于80nm（在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm ）。

HCV感染可引起丙型病毒性肝炎，主要通过输血传播、性传播、生活密切接触传播（如共用剃须刀、牙刷等）。据统计，全球有1.8亿人感染HCV，我国人口的平均感染率为3.2%，有约4千万丙型肝炎病毒携带者。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，HCV感染者有约50%~80%发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化，而肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。丙型肝炎所造成的健康危害和经济损失十分巨大。因此，一种有效、快速、简便的HCV的检测试剂盒对临床HCV辅助诊断均有十分重要的作用。

目前HCV检测方法有ELISA、RIA、测序、实时荧光定量PCR等。其中，ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种试验技术，但其干扰因素较多，重复性不好；灵敏度不够高；容易出现假阳性。RIA是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析技术，但只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性但失去免疫活性的物质是检测不出来的；使用了生物试剂，其稳定性受多种因素影响，不够稳定；灵敏度不够高；是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量；存在放射线辐射和污染。测序是对基因的序列进行判断的一种方法，可以对HCV进行分型检测，但其操作复杂、耗时，且仪器设备昂贵；实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法，其灵敏度高，但需要的仪器设备昂贵，不利于大规模推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒，主要解决现行技术灵敏度低、操作复杂、耗时、所需仪器设备昂贵等问题。本发明试剂盒不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，仅需在恒温条件下即可进行核酸的扩增。

本发明所采取的技术方案是：一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒，包括PCR反应液，PCR反应启动液、PCR反应酶系，HCV的特异性引物及探针，内标18S RNA的特异性引物及探针，阴阳性质控品。其中，所述的HCV特异性引物及探针、内标18S RNA的特异性引物及探针序列如下：

检测HCV的上游引物F1的序列为：

CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC；

检测HCV的下游引物R1的序列为：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC；

检测HCV的荧光探针P1序列为：FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ；

检测内标18SRNA的上游引物F1序列为：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC；

检测内标18SRNA的下游引物R1的序列为：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC；

检测内标18SRNA的荧光探针P1序列为：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应液的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）

Tris-缓冲液50~100mmol/L

KCl20~60mmol/L

二硫苏糖醇 2~5mmol/L

甜菜碱 0.5~2mol/L

海藻糖 1%~4%

PEG2%~5%

BSA0.1~0.6mg/mL

优选的，Tris-缓冲液可选自Tris-H₂SO₄、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应启动液的具体组分如下：

品名 摩尔浓度