[发明专利]基于细长反应腔的全基因组扩增方法

说明书

本发明提出了一种基于细长反应腔的全基因组扩增方法，其特征在于将多重链置换扩增反应体系注入细长型的反应腔中，完成对目标基因组的全基因组扩增。细长形的反应腔体将多重链置换扩增反应体系相对分隔于一个细长的反应腔中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，基于细长反应腔的多重链置换扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，简化了反应系统，降低了操作复杂度。

技术领域

本发明涉及一种采用细长反应腔体进行全基因组扩增反应的技术，是一种实现对全基因组信息进行高效、高均一性扩增的方法，属于生物技术领域。

背景技术

在过去的10年中，使用多重链置换反应(Multiple displacementamplification，MDA)(Genome research,2001,11:1095-1099)进行全基因组扩增(Wholegenome amplification，WGA)的方法得到了很大的关注，多重链置换反应可以完成对低起始量样本的有效扩增，使得扩增后的核酸质量和浓度满足各类应用的需求，特别是满足构建高通量DNA测序文库的需要。

与另一种同样被广泛使用的全基因组扩增技术——聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)技术不同的是，多重链置换反应的主要问题是整个反应过程中的不均匀扩增，导致基因组内的扩增均一性较差，对基因组之间的杂合信息分辨率低。一些研究者将这两种方法混合使用，例如MALBAC(Science,2012,338:1627-1630)和PicoPLEX，在扩增的早期阶段采用随机引物和变温预扩增，后期采用聚合酶链式反应进行扩增的方法，但限制反应的循环数。然而这种混合并没有解决多重链置换反应的不足，与单纯使用PCR和MDA方法比较起来，这些方法也仅仅获得了中间效果。

尽管存在这样的问题，由于MDA具有较高的扩增效率和保真度，依然是较为广泛使用的基于低起始量样本的有效扩增方法。一些基于微流控装置或微液滴的多重链置换扩增方法随后被开发出来，以改善传统多重链置换扩增方法在扩增均一性上的不足。Quake等人将传统的发生在离心管内的多重链置换反应转移到纳升的微流控反应微腔中(PLoSgenetics,2007,3:1702-1708)，证实可以改善扩增反应的偏好性(bias)；在另一些报道中，多重链置换反应体系被转移进微液滴环境中(PNAS,2015,112:11923-11928；Nucleicacids research,2016,44:e66)，结果表明这些扩增偏好会在一定程度上得到抑制。

然而，反应微腔的制备和操作较为复杂，依赖精密的设备和精巧的操作，且费用较为高昂，从零散的材料和设备开始构建整个系统费时费力。将多重链置换扩增转移进油水混合的乳液环境同样对设备和操作的依赖性极大，商业化微液滴发生器机器配件价格较高，并且制备微乳液使用的表面活性剂在一定程度上影响反应的进行。因此，低起始量全基因组扩增、单细胞全基因组扩增等应用迫切需要一种高效、廉价且具有较好均一性的全基因组扩增方法。

发明内容

技术问题：本发明的目的就是针对现有的用于全基因组的多重链置换扩增方法，对基因组不同区域的扩增一致性较差这一现状，以及基于反应微腔和微液滴的多重链置换扩增方法系统复杂、花费高昂和实验流程复杂这一问题，试图通过对反应腔的改造，将反应容器转换为细长的连续反应腔体，提升扩增的均一性，简化系统和实验流程，降低花费。