[发明专利]重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的萃取分离方法

说明书

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中L‑哌啶酸的萃取分离方法。本发明以全细胞催化制备L‑哌啶酸的发酵液为原料，经调节pH值，萃取体系萃取，分离，反萃取，沉淀结晶，最后得到哌啶酸晶体。该方法用三辛胺‑正辛醇‑三磷酸丁酯作为反应萃取体系，解决了L‑哌啶酸在水溶液中溶解度大，不易提纯分离的难题；该方法专一性强，残留杂质少，具有反应条件温和，制备步骤简单，具有工业利用价值等特点。采用本方法制得的哌啶酸晶体有杂质少，为纯品，非钠钾盐，且色素吸附少的优点，此产物可用作制备罗哌卡因等药物的中间体，广泛应用于医药、化工领域。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中L- 哌啶酸的萃取分离方法。

背景技术

哌啶酸(Pipecolic acid，简称PA)是一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，它既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，所以广泛用于许多手性药物和生物活性物质的制备。如，新一代局麻药罗哌卡因(Ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(Thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素 (Rapamycin)以及抗肿瘤抗生素山卓霉素(Sandramycin)等均是以哌啶酸或其衍生物为主要原料制得的。

由于哌啶酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，其合成已引起众多国外研究者的兴趣，并开发出许多合成的新方法和新技术。利用重组大肠杆菌生产手性L-哌啶酸是一种新型生产哌啶酸的方法，其具有产率高选择性高光学纯度高等优点。哌啶酸及其衍生物作为一类应用广泛的医药中间体，市场需求会越来越大。若将上述生物合成哌啶酸的方法转为工业生产，L-哌啶酸分离提纯技术也很重要。随着合成技术、生物技术及药学研究的不断发展，可以预期哌啶酸及其衍生物必定具有更为广泛的应用前景。

申请号为201510268919.3的专利公布了一种L-哌啶甲酸的分离方法，将含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂，树脂吸附饱和后，以碱性溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液结晶、干燥得到L-哌啶甲酸；该方案成本较高，得到的L-哌啶甲酸产品纯度最高为98.2％，不能达到100％。

申请号为201510475733.5的专利公布了一种改进的L-哌啶甲酸的分离方法，将含L-哌啶甲酸的待分离液通过催化树脂，树脂吸附饱和后，以酸性溶液作为洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液结晶、干燥得到L-哌啶甲酸。该方法较上一专利改变了洗脱剂为酸性溶液，其以盐酸洗脱方便树脂的再生，节约生产成本，但产品纯度还是不能达到100％。

目前，有关L-哌啶酸萃取分离的相关文献资料等鲜有报道，因此开发一种专一性强，残留杂质少的萃取分离重组大肠杆菌发酵产物L-哌啶酸的方法在工业生产中具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的萃取分离方法，用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯作为反应萃取体系，解决了L- 哌啶酸在水溶液中溶解度大，不易提纯分离的难题；该方法专一性强，残留杂质少。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的萃取分离方法，包括以下步骤：

1)待分离样品处理：取发酵原液，加入吸附剂充分混匀后加热搅拌，再经滤纸、硅藻土和滤膜过滤，得澄清溶液；

2)反应萃取：取步骤1)所述的澄清溶液调节pH值至7～10，用三辛胺-正辛醇-三磷酸丁酯的反应萃取体系溶液与澄清溶液混合后搅拌萃取；

3)反萃取：将步骤2)中搅拌萃取后的溶液进行离心操作，取上清液，在上清液中加入等体积的水介质混匀后搅拌，搅拌结束后，取下层水相，得L-哌啶酸水溶液。