[发明专利]一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法，属于生物技术及发酵食品领域。本发明针对耐酸乳杆菌的特异性，设计出耐酸乳杆菌的特异性引物，通过改良MRS选择性培养基分离发酵食品中的乳酸菌，利用特异性引物以及菌落聚合酶链式反应(PCR)能够快速准确地鉴定出目的菌株。该引物对适用于传统发酵食品中耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及定量。

技术领域

本发明涉及一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法，属于生物技术及发酵食品领域。

背景技术

耐酸乳杆菌广泛存在于各种发酵食品酿造体系中，包括白酒、黄酒、食醋、泡菜、酱油、酸奶、干酪、酒酿、豆豉、乳腐、黄酒、啤酒、葡萄酒等，并且是发酵食品酿造体系中的优势微生物。通过高通量测序结果表明，在白酒酒醅发酵中后期细菌中有90％以上为耐酸乳杆菌，其优势阶段占据整个发酵阶段2/3的时间，这是由于耐酸乳杆菌能够耐受或适应于高酸度、高乙醇浓度、低含氧量等不利条件的特性所决定的。有研究发现，白酒发酵中后期是乙酸、乳酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯等重要风味物质形成的阶段，而耐酸乳杆菌被认为是生成这些风味物质的重要菌株，因此该菌对白酒的风味具有巨大的贡献。故而对于耐酸乳杆菌的分离鉴定非常重要。但是耐酸乳杆菌为兼性厌氧微生物，营养条件十分苛刻，且耐酸乳杆菌在菌落形态与理化性质上与多数乳酸菌间差异不显著，这给耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及定量工作带来了极大的困难，也是目前对于耐酸乳杆菌研究较少的主要原因。

由于常规培养基缺乏耐酸乳杆菌菌生长所需的独特生长因子，耐酸乳杆菌在常规MRS、番茄汁琼脂(TJA)等培养基上几乎不能生长；此外，目前对于耐酸乳杆菌的筛选鉴定，主要通过菌株的理化性质或16srDNA的方法。这种鉴定方法存在周期长、费用高、成功率低等问题。因此，在耐酸乳杆菌筛选鉴定方面存在很多亟待解决的问题，建立一种快速筛选、鉴定及定量发酵食品中耐酸乳杆菌的方法是十分必要并且具有重要意义的。

发明内容

为解决上述问题，弥补现有乳酸菌筛选、鉴定及定量技术的不足，首先，本发明提供了一种有效提高乳酸菌筛选、鉴定及定量效率的特异性引物。其次，本发明改良了传统的MRS培养，添加多种营养因子提高了乳酸菌的存活率，添加制霉素抑制杂菌的生长，添加溴甲酚绿能快速识别产酸乳酸菌。最后，利用特异性引物能够快速、准确地从产酸乳酸菌中筛选出耐酸乳杆菌。

本发明的第一个内容是提供了一种发酵食品中耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及其特异性定量方法，所述方法是以上述耐酸乳杆菌中糖基水解酶的编码基因的核苷酸序列作为模板设计引物对。

在本发明的一种实施方式中，所述糖基水解酶编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。

本发明的第二个内容是提供了一对特异性引物，以提高耐酸乳杆菌的筛选、鉴定及定量效率，所述特异性引物对序列为LaF1:5′-AACATCCCCAGAGCGTCAAG-3′；LaR1:5′-GGCACTACCCCAAGCATCTT-3′。

本发明的第三个内容是该特异性引物对在耐酸乳杆菌筛选鉴定方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述样品为任意来源含有耐酸乳杆菌的菌体、菌落、菌液以及基因组样品。

在本发明的一种实施方式中，所述筛选是在每升MRS培养基主溶液的基础上，添加1～5mL副溶液混匀使用；副溶液的组成：指示剂溴甲酚绿0.01～0.02g/mL，营养因子D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐、甲瓦龙酸内脂和维生素B11，其中，D-天冬氨酸二甲酯盐酸盐0.01～0.02g/mL、甲瓦龙酸内脂0.005～0.015g/mL、维生素B11 0.01～0.015g/mL，制霉素0.04～0.06g/mL，溶剂为二甲基亚砜，使用无菌滤膜过滤灭菌。