[发明专利]三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，该试剂盒包括阴性对照、需钠弧菌（Vibrio natriegens）XA1菌株DNA作阳性对照、含Mg²⁺、dNTP和DNA聚合酶的PCR缓冲液和引物对等。本发明还公开了一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测方法，该方法包括DNA模板的提取：PCR预混合液的配制和PCR扩增，扩增反应结束后电泳在紫外分析仪下观察结果:若在308bp和526bp处出现条带为阳性，否则为阴性。本发明具有较高的灵敏性，最低可以检测出13.2pg的需钠弧菌基因组DNA，操作简单，不需要专门技术人员，而且全程时间很短，耗时少。

技术领域

本发明涉及一种病原菌的检测试剂盒与检测方法，特别是一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒与检测方法。

背景技术

需钠弧菌是海洋微生物中常见的兼性厌氧细菌，广泛存在于河口入海处、近海岸的海水、海底沉积物及海生动物中，是一种条件致病菌，可导致水产养殖动物患病死亡，死亡率高达87.5-100%，严重危害我国海水养殖业的健康发展。

目前鉴定弧菌的技术有：

1、经典的生理生化鉴定方法，该法繁琐、耗时、且要求操作人员有良好的专业素养；

2、细菌快速自动鉴定系统，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；

3、基于核酸的检测技术，包括DNA探针和PCR技术 (聚合酶链式反应技术)，相对上述检测技术而言，该技术具有快速、简捷、灵敏等特点。

但是，目前针对该需钠弧菌的研究主要停留在病原的分离和实验室鉴定，还没有一个快速检测方法报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，实现三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速、准确检测。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了应用上述试剂盒进行三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒，其特点是，该试剂合由下列物品组成：

1)阴性对照，成份为 1mL 灭菌双蒸水 1 支 ;

2)阳性对照，试剂成份为溶于1mL灭菌双蒸水中100ng的需钠弧菌（Vibrio natriegens）XA1菌株DNA 1支；

3)含Mg²⁺、dNTP和DNA聚合酶的PCR缓冲液 1支；

4)引物对toxR-F/toxR-R

toxR-F为：5'-AAT CCG CTT TCC TCT GTT-3' 1支；

toxR-R为：5'-GGC GTT AGC ACA GGT ACA-3' 1支；

5)引物对Vhh-F /Vhh-R

Vhh-F：5'-AAT GTC ATC CGC CAA CGA-3' 1支；

Vhh-R：5'-CCG TCA GGC GAA TCA ATG-3' 1支；

6)灭菌双蒸水 1支；

7)包装盒子，一块泡沫板，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中； 将阳性对照单独存放；试剂盒于 -20°C保存。