[发明专利]棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学及分子生物学领域，特别是涉及一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法。

背景技术

棉花黄萎病是危害棉花的重要病害之一，成为制约我国棉花生产仅次于棉铃虫的第二大杀手。其病原菌为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，由于其为土传性维管束真菌性病害，目前缺乏有效的防治措施。由于该菌易于变异，因而经常出现同一个品种在不同地区的表现抗病性不同的情况。收集不同地区菌株，快速提取其DNA，准确地鉴定棉花黄萎病菌种群多样性及菌系间的亲缘关系和变异程度，对于抗病育种工作及病害的防治具有重要的实践意义。棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究主要分为黄萎病病原菌的分离、真菌DNA提取和研究真菌多样性等步骤。

目前黄萎病病原菌的分离采用的是常规组织分离法。首先采集黄萎病病株，然后用升汞、双氧水或次氯酸钠消毒，无菌水冲洗3-4遍，然后培养、纯化，纯化后再根据需要再培养。升汞即氯化汞，剧毒，渗透性强，通常用于组织分离时消毒部分，操作要十分谨慎。升汞灭菌后要无菌水冲洗数遍，再用无菌滤纸把残余的水分吸干，以防残留的升汞影响病原菌生长。为防止交叉污染，一般每分离一个样品就要换一套冲洗器皿，所用器皿也非常多，在有限的超净台里面显得非常拥挤，容易混乱，平均每个样品耗时10min分钟左右。双氧水或次氯酸钠消毒，同样需要类似的步骤。

现阶段，真菌DNA提取方法都基于菌丝的获得。大丽轮枝菌一般是边生长边产生大量的孢子和菌核，生长缓慢，培养物质地比较坚硬，附在培养基表面，很少有蓬松的气生菌丝，不易直接从培养基上获得菌丝。需要从纯化后培养10-15d平板上打菌饼接种于Czapek’s液体培养基中，26℃，200r·min^-1振荡培养4-7d，纱布过滤，无菌水冲洗2-3遍，晾干，待用。真菌细胞壁含有甲壳素，晾干之后十分坚硬，研磨仪器研磨不彻底。目前一般采用人工研磨方法，在研钵中加液氮研磨，反复数次，需要大量菌丝，十分费力耗时，平均每个样品至少需要10min。

研究真菌多样性时样品少则几十份，多则两三百份。再加之采样地点距离远，路途长，天气炎热时，样品极易腐烂。由于分离消毒十分耗时，一般不能做到及时分离，因而造成样品存放时间长，分离易污染甚至不能纯化出病原菌现象。样品量大时消毒、冲洗等步骤繁琐，也易于混淆。获得DNA时需要摇菌，此时需要大量的三角瓶、液体培养基及足够数量的摇床。这对研究真菌多样性的研究者来说，最具挑战性的莫过于样品的及时快速分离纯化及高通量DNA的获得。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)简单重复序列区间扩增，广泛存在于绝大部分的基因组DNA中，并且进化变异速度快。ISSR现已广泛用于植物的品种鉴定、遗传作图、基因定位、分类、进化及遗传多样性等方面的研究。目前，ISSR分子标记技术体系的研究，多选择25μL反应体系，扩增成本高。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种新型的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，所要解决的技术问题是使其缩短了棉花黄萎病病原菌分离纯化及遗传多样性的研究时间，从而更加适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其步骤包括:

1)分离病原菌：将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭，剥皮，除去剥皮后的头端后，截成小段，埋入第一培养基，得到孢子和菌丝；

2)单孢分离纯化：用接种环刮取所述的孢子和菌丝，和无菌水混合，得到孢子和菌丝悬浮液；取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线，得到菌落；用接种针挑取单菌落点到第三培养基中，得到直径5-8cm的菌落；

3)真菌DNA提取：取所述第三培养基上的培养物于离心管，吹干，加入磁珠，在液氮中冷冻后，震荡研磨，提取DNA，并用凝胶电泳检测提取质量；

4)建立ISSR体系。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的棉秆小段为0.5-1.0cm。

优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的第一培养基、第二培养基和第三培养基均为PDA培养基。

优选的，前述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其中所述的第一培养基的培养条件为26℃黑暗培养3-4d；所述的第二培养基的培养条件为26℃黑暗培养2-3d；所述的第三培养基的培养条件为26℃黑暗培养10-20d。