[发明专利]棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法

权利要求书

1.一种棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，其步骤包括:

1)分离病原菌：将棉花黄萎病病株的棉秆用乙醇擦拭，剥皮，除去剥皮后的头端后，截成小段，埋入第一培养基，得到孢子和菌丝；

2)单孢分离纯化：用接种环刮取所述的孢子和菌丝，和无菌水混合，得到孢子和菌丝悬浮液；取孢子和菌丝悬浮液在第二培养基划线，得到菌落；用接种针挑取单菌落点到第三培养基中，得到直径5-8cm的菌落；

3)真菌DNA提取：取所述第三培养基上的培养物于离心管，吹干，加入磁珠，在液氮中冷冻后，震荡研磨，提取DNA，并用凝胶电泳检测提取质量；

4)建立ISSR体系。

2.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的棉秆小段为0.5-1.0cm。

3.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的第一培养基、第二培养基和第三培养基均为PDA培养基。

4.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的第一培养基的培养条件为26℃黑暗培养3-4d；所述的第二培养基的培养条件为26℃黑暗培养2-3d；所述的第三培养基的培养条件为26℃黑暗培养10-20d。

5.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的步骤3)中的培养物的含量为0.2-0.5g。

6.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的磁珠的直径为5-10mm。

7.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的震荡研磨为间歇式，每次震荡研磨时间为1-3min，频率为20-30frequency 1/s。

8.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的提取DNA的方式为CTAB或真菌DNA提取试剂盒提取DNA。

9.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的凝胶电泳为1％琼脂糖凝胶电泳。

10.根据权利要求1所述的棉花黄萎病原菌遗传多样性的研究方法，其特征在于，所述的ISSR体系的分子标记优化反应体积为10μL，其包括：

5μL 2×Taq PCR MasterMix，引物0.5-1μmol·L^-1，模板DNA 20-50ng，ddH₂O补齐10μL；

ISSR扩增条件为94℃退火5min，94℃退火45s，72℃延伸1min、40个循环，最后延伸7min。