[发明专利]一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段及其应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段及其应用。该DNA片段为如下任一序列：(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或者其互补序列；(c)对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。本发明的DNA片段具有启动子的功能，同时具有很强的表达活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，可将其运用于耐热β‑半乳糖苷酶和转谷氨酰胺酶的表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达分泌系统提供了有效的元件。

技术领域

本发明涉及一种DNA片段，特别涉及一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段及其应用。

背景技术

通过基因重组技术生产有价值的外源蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一。细菌具有生长快、易培养、表达量高以及分子操作简单的特点，这使得它们已广泛地开发应用于异源蛋白质的表达。其中，枯草芽抱杆菌由于其安全无毒、遗传背景清晰、分泌表达水平高等诸多优点，而成为工业用理想的宿主细胞。

枯草芽抱杆菌中表达异源蛋白需要各种元件，其中启动子对于表达水平的影响至关重要。通常有两种思路进行启动子的遗传改造：一种方式是对目的基因本身的启动子进行突变改造，从而提高启动子的活性；另一种方式是将原有的启动子替换成其他的天然或人工构建的启动子，从而彻底改变下游基因的表达谱，实现对基因转录水平的人为控制。目前成功用于枯草芽抱杆菌表达系统的启动子主要有P43、PamyQ、Pspac、PxylA等，这些启动子在实验室的富集培养基中表现良好，但鲜见它们被用于酶蛋白的工业放大生产。因此，有必要找到更高效的、适合于工业培养基生产表达的启动子，以适应发酵对表达水平越来越高的要求。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段。

本发明的另一目的在于提供所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，所述DNA片段为如下任一序列：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者其互补序列；

(b)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或者其互补序列；

(c)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。

所述的核糖体结合位点的序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述的枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段在蛋白表达中的应用。

一种载体，包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的核糖体结合位点的序列。

所述的载体优选为质粒载体，含有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

一种表达质粒，包含上述载体以及与该载体可操作连接的位于所述具有启动子功能的DNA片段下游编码异源蛋白质核苷酸序列。

所述的异源蛋白质核苷酸序列为好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)编码的耐热β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，或为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensia)编码的转谷氨酰胺酶的核苷酸序列。

一种重组工程细胞，为上述载体或者上述质粒转化或转导宿主细胞得到的细胞株。

所述的宿主细胞为芽孢杆菌。