[发明专利]一种酪氨酸磷酸化蛋白质定量分析方法

说明书

本发明涉及一种酪氨酸磷酸化蛋白质定量分析方法，该方法是以经过修饰的SH2超亲体为一抗，基于ELISA法，得到待测样品中酪氨酸磷酸化水平的动态变化曲线，检测过程中，以酪氨酸磷酸化标准蛋白为参照样品得到标准曲线，以标准曲线为参照，实现待测样品中酪氨酸磷酸化水平定量分析；该方法成本低、无需样品预富集、特异性好、检测限低。此外，ELISA法在孔板中进行，仪器简单。所采用的SH2超亲体可通过细菌表达、纯化得到大量结构稳定的蛋白，大大节约了实验成本，背景清楚，方便改造。其对酪氨酸磷酸化蛋白具有和抗体一样的高亲和高特异性且相对广谱的特点，成功实现对多个复杂样品的酪氨酸磷酸化水平定量分析。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向酪氨酸磷酸化蛋白质组学技术领域，具体涉及一种酪氨酸磷酸化蛋白质定量分析方法。

背景技术

酪氨酸磷酸化信号转导系统参与许多重要的细胞生物学功能，如细胞分化、增殖、迁徙和凋亡等等(文献：Hunter,T.,Cell 2000,100,113–127.)，当其发生异常时，常常伴随疾病的发生，尤其是癌症(文献：Rix,U.；Superti-Furga,G.,Nat.Chem.Biol.2009,5,616-624.)。因此，对酪氨酸磷酸化信号通路的研究是目前生物医学领域的一个重点，截止目前，美国食品药品监督管理局(FDA)批准的26款用于癌症靶向治疗的激酶抑制剂中，22个(84％)靶向酪氨酸磷酸化激酶(文章：Gharwan,H.；Groninger,H.,Nat.Rev.Clin.Oncol.2009,advance online publication.)。为了更深入的理解和研究酪氨酸磷酸化调控网络，为酪氨酸磷酸化激酶功能失调相关的癌症分子诊治提供基础，我们有必要发展创新的技术手段用于酪氨酸磷酸化蛋白质的定性定量分析。

然而，酪氨酸磷酸化仅占所有蛋白质磷酸化比例的约0.05％，而且它是一个动态、瞬变的过程(文章：Hunter,T.,Cold Spring Harb Perspect Biol 2014,6,a020644.)。这也给酪氨酸磷酸化蛋白的定量分析带来了很多困难。最近，Tao课题组基于用钛离子多功能修饰的pIMAGO试剂发展了一种对复杂样品总体磷酸化水平定量分析的新方法(文章：Pan,L.；Wang,L.；Hsu,C.C.；Zhang,J.；Iliuk,A.；Tao,W.A.,Analyst 2015,140,3390-3396.；文章：Iliuk,A.；Martinez,J.S.；Hall,M.C.；Tao,W.A.,Anal.Chem.2011,83,2767-2774.；文章：Iliuk,A.；Li,L.；Melesse,M.；Hall,M.C.；Tao,W.A.,Chembiochem 2016,17,900-903.)，然而，该方法无法区分所定量分析的磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸还是酪氨酸上，因此，其不能用于复杂样品中酪氨酸磷酸化蛋白的定量分析。此外，近年来，随着质谱技术的发展，质谱成为蛋白质组学研究的一个重要工具。其中，复杂样品在质谱分析之前，基于抗体的预富集是非常必要的(文章：Rush,J.,Moritz,A.,Lee,K.A.,Guo,A.,Goss,V.L.,Spek,E.J.,Zhang,H.,Zha,X.M.,Polakiewicz,R.D.,and Comb,M.J.(2005)Immunoaffinityprofiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells.Nature biotechnology23,94-101.)。目前，商品化的酪氨酸磷酸化抗体也出现了很多，如：PT66、anti-pTyr-4G10、PY99、P-Tyr-100。但是，这些抗体价格昂贵，批次之间重复性往往较差，量少，考虑到有大量的酪氨酸磷酸化位点需要鉴定，昂贵的抗体很难满足这种需求。除此之外，质谱在用于复杂样品中酪氨酸磷酸化蛋白定量分析时还面临着一些困难：首先，很多研究者可能接触不到质谱检测所需要的昂贵的专业仪器；其次，基于质谱的定量分析所需要的样品量往往较大；更重要的是，其单次实验可同时定量分析的样品数量有限。由此，一些生物学的方法如酶联免疫吸附测定，作为质谱分析方法一个很好的替代方法，常常用于复杂样品中酪氨酸磷酸化蛋白的定量分析，但是目前其也主要依赖酪氨酸磷酸化抗体，也因此该方法同样面临着质谱分析中抗体所面临的问题。