[发明专利]一种酪氨酸磷酸化蛋白质定量分析方法

权利要求书

1.一种酪氨酸磷酸化蛋白质定量分析方法，其特征在于：

以经过修饰的SH2超亲体为一抗，基于酶联免疫吸附法(ELISA法)作为定量分析方法，得到待测样品中酪氨酸磷酸化水平的动态变化曲线，检测过程中，以酪氨酸磷酸化标准蛋白为参照样品得到标准曲线，以标准曲线为参照，实现待测样品中酪氨酸磷酸化水平定量分析；

具体为：以已知质量浓度的进行梯度稀释的酪氨酸磷酸化标准蛋白作为参照样品与梯度稀释的待测样品按照酶联免疫吸附法进行定量分析，对参照样品中不同质量浓度所含酪氨酸磷酸化蛋白质量与信号强度值建立标准曲线，所述参照样品的标准曲线的横坐标为参照样品的蛋白质量，纵坐标为信号强度值；并将一同操作条件的待测样品的动态变化曲线插入该标准曲线，所述待测样品的动态变化曲线的纵坐标为信号强度值，根据信号强度值与参照样品的标准曲线的纵坐标进行比对，得到待测样品中相同信号强度值对应酪氨酸磷酸化蛋白质的质量。

2.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

通过所述定量分析方法同时定量分析多个复杂待测样品的酪氨酸磷酸化蛋白水平。

3.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

所述SH2超亲体氨基酸序列No.1为：

WYFGKITRRESERLLLNAENPRGTFLVRESETVKGAYALSVSDFDNAKGLNVKHYLIRKLDSGGFYITSRTQFNSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTTVCPTSK。

4.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

所述SH2超亲体的修饰方法可以为细菌表达、纯化或生物素化修饰以获得稳定的SH2超亲体。

5.根据权利要求4所述的定量分析方法，其特征在于：

所述细菌表达、纯化步骤为：

将转染了序列N端带有组氨酸和谷胱甘肽S转移酶标签的SH2超亲体融合蛋白的质粒的大肠杆菌在含有5-500g/mL抗生素的LB(Luria-Broth)液体培养基中培养至OD₆₀₀为0.6-0.8后，向培养基中加入0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，4-37℃，100-500转/分钟，摇床中震荡过夜，之后4-37℃离心10-30分钟收集细菌菌体，裂解液重悬，超声提取蛋白，再次4-37℃离心10-30分钟，并收集上清；利用组氨酸标签首先通过镍柱纯化SH2超亲体蛋白，上样后，通过5-100mM咪唑洗涤除去细菌裂解液中的杂蛋白，200-500mM咪唑洗脱SH2超亲体蛋白，凝胶排阻柱除去咪唑，进一步纯化SH2超亲体蛋白，测定蛋白质浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定蛋白质纯度，得到细菌表达、纯化后的SH2超亲体蛋白；

所述生物素化修饰方法为：

取0.2-10mg/mL SH2超亲体与生物素化试剂生物素-NHS以摩尔比为1:1-1:10避光震荡反应，4-37℃反应1-24小时；

向反应体系中加入过量(SH2超亲体与NH₄Cl摩尔比大于1)的NH₄Cl终止反应；反应后的溶液用10k超滤管超滤，PBS洗涤后倒置超滤管，收集液体；使用BCA法测定得到的SH2超亲体与生物素交联后的溶液(SH2-生物素)的浓度；使用HABA法测定得到的SH2-生物素溶液平均每个SH2上标记生物素个数；使用ELISA方法评价最佳比例；最后将得到的SH2-生物素溶液分装，-20～-80℃冻存待用。

6.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于：

所述待测样品和参照样品为带有酪氨酸磷酸化修饰的蛋白或肽段，例如phosphotyrosine-BSA、带有酪氨酸磷酸化位点的表皮因子生长受体蛋白、细胞裂解液、组织提取蛋白、细胞酶解液、带有酪氨酸磷酸化位点修饰的肽段。