[发明专利]微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法

权利要求书

1.一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：

A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物用编码透明颤菌血红蛋白的核酸序列的重组核酸分子转化，编码透明颤菌血红蛋白的核酸序列含有增加透明颤菌血红蛋白的活性的遗传修饰，所述遗传修饰为在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：61的第45位甲硫氨酸被亮氨酸取代、第86位半胱氨酸被甘氨酸取代和第95位酪氨酸被丝氨酸取代；和

B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

2.如权利要求1所述的方法，其中，编码所述透明颤菌血红蛋白的核酸序列为SEQ IDNO：64。

3.如权利要求1所述的方法，其中，重组核酸分子中编码透明颤菌血红蛋白的基因拷贝数大于或等于1。

4.如权利要求1所述的方法，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。

5.如权利要求4所述的方法，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述微生物进一步包含下述遗传修饰中的一种或多种：

(1)包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰；

(2)包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖-6-磷酸异构酶作用的遗传修饰；

(3)包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰；

(4)包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰；

(5)包含至少一种能提高微生物中UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖-2-异构酶作用的遗传修饰。

7.如权利要求6所述的方法，其中，提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰选自a)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性增加；和/或b)微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶被过量表达。

8.如权利要求7所述的方法，其中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。

9.如权利要求7所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列的重组核酸分子转化，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列含有增加N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的酶活性的遗传修饰，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：17的第36位赖氨酸被精氨酸取代、第103位异亮氨酸被蛋氨酸取代和第223位精氨酸被丝氨酸取代。

10.如权利要求9所述的方法，其中，编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的核酸序列为SEQID NO：26。

11.如权利要求9所述的方法，其中，重组核酸分子中编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因拷贝数增加。

12.如权利要求9所述的方法，其中，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子。

13.如权利要求12所述的方法，其中，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子。

14.如权利要求7所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码N-乙酰-D-氨基甘露糖激酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。