[发明专利]奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及奶牛新孢子虫检测领域，特别涉及奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

新孢子虫是一种细胞内寄生的原生病原体，在全世界范围内流行，主要引起奶牛流产、死胎以及犬科动物的致命神经系统疾病。感染新孢子虫会导致奶牛体重和产奶量下降，从而过早被淘汰，造成重大的经济损失。1984年在挪威报道了第1例因狗感染新孢子虫引起神经肌肉病变，从而导致后肢瘫痪的病例，随后确定犬科动物是新孢子虫的终末宿主。该病原体的传播途径分为垂直传播和水平传播，而经胎盘的垂直传播是奶牛新孢子虫主要传播途径。综上，建立一种快速简便的新孢子虫检测方法显得尤为重要，用于环境评估，食品安全检测，养殖场现场诊断等，进而采取措施遏制传播。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及其检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是提供一种奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒。

所述试剂盒包括以下几种成分：引物、探针混合液，冻干酶，反应预混液，横向流动试纸条和PBST；

所述引物、探针混合液中引物和探针的序列各自为：

上游引物：5'-TGGTAGCGGTGAGAGGTGGGATACGTGGTT-3'；

下游引物：5'-Biotin-GCACTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCTGCC-3'；

探针：5'-FAM-CGTCAGGGTGAGGACAGTGTGTCAATGATA[THF]TTATCGAGAGTTCAG-/C3-Spacer/-3'；

所述PBST的制备方法为：将1ml的Tween-20溶于1000ml PBS中，混匀即可。

进一步的，引物、探针混合液的制备方法为：将10μM上游引物2.1μl，10μM下游引物2.1μl，10μM探针0.6μl混合于4.8μl纯水中。

进一步的，所述引物和探针基于新孢子虫NC-5基因设计。

本发明的第二个目的是提供奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，并使用上述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒，检测方法包括以下几个步骤：

(1)对新孢子虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；

扩增时使用的引物、探针各自为：

上游引物：5'-TGGTAGCGGTGAGAGGTGGGATACGTGGTT-3'；

下游引物：5'-Biotin-GCACTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCTGCC-3'；

探针：5'-FAM-CGTCAGGGTGAGGACAGTGTGTCAATGATA[THF]TTATCGAGAGTTCAG-/C3-Spacer/-3'；

(2)将扩增产物滴加到横向流动试纸条加样端进行检测，判定新孢子虫阳性或阴性。

进一步的，所述步骤(1)中重组酶聚合酶扩增反应的体系为：新孢子虫核酸样品1μl，引物、探针混合液17μl，冻干酶5mg，反应预混液32μl；最优反应条件为：37℃-39℃下反应20分钟。

进一步的，所述步骤(2)中将扩增产物滴加到横向流动试纸条加样端进行检测的具体方法为：取2μl扩增产物到98μl PBST中，混匀后吸取10μl溶液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直插入装有200μl PBST的离心管中，5分钟后观察结果；

进一步的，所述PBST的制备方法为：将1ml的Tween-20溶于1000ml PBS中，混匀即可。

本发明的第三个目的是提供了上述奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法在检测新孢子虫中的应用，其特征在于：所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的。

作为优选，所述奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸来源于新孢子虫的所有基因型及所有虫体发育阶段。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：