[发明专利]奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及试剂盒在审
| 申请号： | 201710214228.4 | 申请日： | 2017-04-01 |
| 公开（公告）号： | CN107058533A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 周东辉;田艾灵;侯俊玲;李法财;吴耀东;朱兴全 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)11350 | 代理人： | 汤东凤 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 奶牛 流产 胎儿 孢子 核酸 快速 检测 方法 试剂盒 | ||
1.奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下几种成分：引物、探针混合液，冻干酶，反应预混液，横向流动试纸条和PBST；
所述引物、探针混合液中引物和探针的序列各自为：
上游引物：5'-TGGTAGCGGTGAGAGGTGGGATACGTGGTT-3'；
下游引物：5'-Biotin-GCACTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCTGCC-3'；
探针：5'-FAM-CGTCAGGGTGAGGACAGTGTGTCAATGATA[THF]
TTATCGAGAGTTCAG-/C3-Spacer/-3'；
所述PBST的制备方法为：将1ml的Tween-20溶于1000ml PBS中，混匀即可。
2.根据权利要求1所述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，引物、探针混合液的制备方法为：将10μM上游引物2.1μl，10μM下游引物2.1μl，10μM探针0.6μl混合于4.8μl纯水中。
3.根据权利要求1所述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒，其特征在于，所述引物和探针基于新孢子虫NC-5基因设计。
4.奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法使用权利要求1或2所述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒，检测方法包括以下几个步骤：
(1)对新孢子虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；
扩增时使用的引物、探针分别为：
上游引物：5'-TGGTAGCGGTGAGAGGTGGGATACGTGGTT-3'；
下游引物：5'-Biotin-GCACTCGCCAGTCAACCTACGTCTTCTGCC-3'；
探针：5'-FAM-CGTCAGGGTGAGGACAGTGTGTCAATGATA[THF]
TTATCGAGAGTTCAG-/C3-Spacer/-3'；
(2)将扩增产物滴加到横向流动试纸条的加样端进行检测，判定新孢子虫阳性或阴性。
5.根据权利要求4所述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中重组酶聚合酶扩增反应的体系为：新孢子虫核酸样品1μl，引物、探针混合液17μl，冻干酶5mg，反应预混液32μl；最优的反应条件为：37℃–39℃下反应20分钟。
6.根据权利要求4所述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中将扩增产物滴加到横向流动试纸条加样端进行检测的具体方法为：取2μl扩增产物到98μl PBST中，混匀后吸取10μl溶液滴加到横向流动试纸条的加样端，并将加样端竖直插入装有200μl PBST的离心管中，5分钟后观察结果；所述PBST的制备方法为：将1ml的Tween-20溶于1000ml PBS中，混匀即可。
7.根据权利要求1或2所述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒在检测新孢子虫核酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸来源于新孢子虫的所有基因型及所有虫体发育阶段。
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