[发明专利]一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针及其原位荧光杂交检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分子检测领域，涉及一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针及其原位荧光杂交检测方法。

背景技术

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，N.b)是家蚕微粒子病的病原，不仅能够水平传播，而且能够经卵垂直传播感染后代家蚕，对生产危害巨大，是蚕种生产中的法定检疫对象。由于N.b营专性细胞内寄生，无法离体培养，且其孢子结构特殊，多数常规研究方法不能使用或尚未建立，因此其研究受到诸多技术限制，以致目前对其生活周期、侵染过程、致病机理等重要特征都尚不明确。目前生产上的蚕种检测主要是显微镜检母蛾和成品卵中具有折光性的N.b的孢子，而对非孢子时期的N.b则无法进行镜检检查。

家蚕微孢子虫的生活周期大概分为三个阶段，即感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。目前常用的家蚕微孢子虫观察方法主要有三种：一是利用DAPI、DY96等染料对家蚕微孢子虫的细胞核进行染色观察，但此法只能显示细胞核和几丁质成分，而不能显示家蚕微孢子虫的完整轮廓特征，并且其宿主的细胞核也会被同时标记，对观察病原有一定的干扰；二是通过制备家蚕微孢子虫的特异性抗体进行标记观察，但此法耗时长、成本高、稳定性差；三是利用扫描电镜和透射电镜技术对不同时期的家蚕微孢子虫进行直接观察，但该方法操作繁琐、制样难度大、难以长期频繁使用。因此，研究和生产上需要建立一种更直观、简便、特异的方法来检测家蚕微孢子虫。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是研究中常用的标记观察技术。利用荧光标记的特异性RNA或DNA探针对细胞内的核酸进行标记，能够快速简便的对不同物种不同时期的细胞进行特异性的观察。此技术的关键是设计特异高效的标记探针，并有针对性地建立标记流程。然而，由于家蚕微孢子虫前期研究基础薄弱，缺乏充分的分子数据，及其结构特殊、无法离体培养的特征，以致尚未发明出家蚕微孢子虫的FISH标记方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种能特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针；本发明的目的之二提供在感染家蚕微孢子虫的细胞中特异性地标记出家蚕微孢子虫荧光核酸探针；本发明的目的之三是提供在感染家蚕微孢子虫的细胞中特异性地标记出家蚕微孢子虫的荧光原位杂交方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针，核酸探针序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.含有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的荧光探针，荧光探针由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2和荧光染料组成，所述荧光染料结合在核酸探针的5’端或3’端。

进一步，所述荧光染料为Cy3、Cy5、FITC、FAM、Alexa Fluor 488或Biotin。

进一步，所述荧光染料为Cy3。

3.利用荧光探针特异性标记家蚕微孢子虫的荧光原位杂交方法，荧光原位杂交方法为以下步骤：

(1)用多聚甲醛对感染家蚕微孢子虫的细胞进行固定，所述荧光探针用杂交液进行稀释至终浓度为3～5ng/μL，于46℃进行杂交，杂交10～12小时，再用杂交清洗液清洗非特异性结合的探针，于48℃清洗1～4小时；

(2)用100ng/μL DAPI对细胞的细胞核以及家蚕微孢子虫的细胞核进行标记，室温染色30min，PBS清洗，封片，再用荧光显微镜，选取相应的激发波长观测荧光探针标记结果。

进一步，所述细胞为家蚕胚胎细胞、家蚕卵巢细胞或草地贪夜蛾细胞。

进一步，所述细胞为家蚕胚胎细胞。

进一步，所述多聚甲醛的质量浓度为4％；杂交液为含有900mM NaCl,20mM Tris,0.01％SDS,PH值为7.5的水溶液；所述杂交清洗液为含有900mM NaCl,20mM Tris，0.01％SDS,5mM EDTA PH值为7.5的水溶液。

进一步，所述PBS清洗是用PBS清洗1～5次，每次5～10分钟。