[发明专利]一种小黄鱼和大黄鱼幼鱼的PCR鉴定方法及引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种物种的鉴定方法，特别涉及一种小黄鱼和大黄鱼幼鱼的PCR鉴定方法及引物。

背景技术

小黄鱼(Larimichthys polyactis)和大黄鱼(Larimichthys crocea)均隶属于鲈形目、鲈亚目、石首鱼科、黄鱼属，都曾是我国有名的四大海产。大黄鱼和小黄鱼体型相似，一般通过尾柄长与尾柄高比值进行区分，但对于大黄鱼和小黄鱼幼鱼，小黄鱼和大黄鱼在幼鱼阶段形态十分相近，由于体型小，量度特征进行种类鉴定存在较大误差，且仅从外部形态上区分这两个物种是十分困难的，不利于种质资源的保护。

为了准确评估大黄鱼资源，建立一种小黄鱼和大黄鱼幼鱼的快速鉴定方法十分必要。种质资源的鉴别除传统的形态分类学方法外，另有生物化学及基因指纹相关方法。其中尤以基因指纹方法应用广泛，见于各种刑侦、医学、科研等领域，特别是在科研中应用于各类形态相似物种的区别与鉴定。

发明内容

本发明的目的在于一种小黄鱼和大黄鱼幼鱼的PCR鉴定方法，简便易行，特异性高，可以清楚地鉴别区分形态相似的小黄鱼和大黄鱼幼鱼。

本发明还提供了用于鉴定小黄鱼和大黄鱼幼鱼的引物，特异性强。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种小黄鱼和大黄鱼幼鱼的PCR鉴定方法，所述PCR鉴定方法步骤为：提取样品的基因组DNA，采用鉴定引物对提取的DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条扩增条带的为小黄鱼，出现两条扩增条带的为大黄鱼；所述鉴定引物序列如下：

COI-F：5’-GTTACGGCACATGCYTTCGT-3’

COI-R1：5’-GGAAACACCTGCGAGGTGTA-3’

COI-R2：5’-TARAGGATGGGATCGCCTCC-3’。

本发明采用分子生物学手段，对小黄鱼和大黄鱼幼鱼的基因进行提取和筛选，从而将小黄鱼和大黄鱼幼鱼这两个不同物种区分开来，方法简便易行，特异性高。本发明采用特异的引物扩增小黄鱼和大黄鱼幼鱼的DNA，然后进行凝胶电泳分析，可以将两者的DNA显著区分开，从而可以将形态相似的小黄鱼和大黄鱼幼鱼也区分开。

小黄鱼样品在500bp位置扩增出一条带，而大黄鱼样品在300bp和500bp处各出现一条亮带，通过带型不同可以快速鉴别小黄鱼和大黄鱼幼鱼样品。

作为优选，所述PCR扩增体系为：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，COI-F 1μl，COI-R1 1μl，COI-R2 1μl，Taq酶0.15μl，DNA模板1μl，ddH₂O补足体系至25μl。

作为优选，dNTP的终浓度为0.8mM，COI-F的终浓度为1μM，COI-R1的终浓度为1μM，COI-R2的终浓度为1μM，Taq酶终浓度为0.04U/μl。

作为优选，所述PCR扩增条件为：94℃预变性3min，后经过40个循环，每个循环包括94℃45s，50℃45s，72℃45s；最后72℃延伸10min。

一种用于鉴定小黄鱼和大黄鱼幼鱼的引物，包括三条特异性引物，引物序列如下：

COI-F：5’-GTTACGGCACATGCYTTCGT-3’(SEQ ID No.1)

COI-R1：5’-GGAAACACCTGCGAGGTGTA-3’(SEQ ID No.2)

COI-R2：5’-TARAGGATGGGATCGCCTCC-3’(SEQ ID No.3)。

其中，混合碱基：R表示A+G，Y表示C+T。

本发明的有益效果是：简便易行，特异性高，可以清楚地鉴别区分形态相似的小黄鱼和大黄鱼幼鱼。

附图说明

图1是本发明的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一、采用酚/氯仿方法进行DNA提取：对用95％酒精或-20℃冷冻保存的小黄鱼和大黄鱼样品，取背部肌肉组织50-100mg，采用传统法(酚/氯仿抽提法)从提取基因组DNA。

详细方法和步骤如下：