[发明专利]一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法

说明书

一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，本发明涉及生物工程和生物制药技术领域，为解决抗菌肽在毕赤酵母中的表达效果差，更重要的是利用甲醇诱导表达的抗菌肽产品中存留甲醇，甲醇毒性使这种抗菌肽产品无法在食品、饲料和医药领域中应用，本发明提供的技术方案为向接种后的培养基内添加诱导物氯化胆碱，使培养基内的氯化胆碱的终浓度为1％‑5％w/v。本发明的优势在于：PisL9K22WK表达水平高、生产成本低及产品安全无毒害残留，该工程酵母菌及其生产的pisL9K22WK产品可应用于抗菌药物或动物及水产养殖饲料添加剂。

技术领域

本发明涉及生物工程和生物制药技术领域，更具体地，涉及一种使用无毒诱导物来诱导改良石斑鱼抗菌肽pisL9K22WK在粉红毕赤酵母(pichia pink)高效表达的方法。

背景技术

抗菌肽(AMP)是生物体内带正电荷、富含阳离子和具有两亲性结构的小分子多肽，主要特点如下：抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，对细菌不易产生耐药性，进入机体后代谢速度快，不易在机体产生有害残留，而且对真菌、病毒、原生动物甚至肿瘤都具有杀伤作用或抑制作用。由于其突出的生物学特性，最有潜力作为型新安全无害抗生素替代品，从而备受科学界关注，但是抗菌肽的天然提取或者化学合成的成本过高，造成抗菌肽产品的价格昂贵，无法在实际生产中大规模应用。

PisL9K22WK是以马拉巴石斑鱼多肽piscidin为基础的改良抗菌肽(如申请201410545484.8中公开)，相比于改造前，PisL9K22WK的溶血活性降低，细胞毒性减少，而抗菌活性基本保持不变，具有更优良的临床应用价值，是一种最具潜力的临床的抗生素替代药物。

利用毕赤酵母生产抗菌肽是降低抗菌肽产品成本的重要途径，毕赤酵母表达系统具有其它表达系统不可比拟的优势，如毕赤酵母基因操作简单；外源蛋白表达量高，既可以胞内表达，也可以分泌表达；外源蛋白基因遗传稳定，另外，作为真核表达系统，毕赤酵母具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

粉红毕赤酵母(pichia pink)表达系统是基于巴斯德毕赤酵母的真核生物蛋白表达系统，可用于外源蛋白的高产量及大规模生产。该系统除了具有巴斯德毕赤酵母的优点外，还有以下特点：ADE2基因缺失型标记利于表达克隆的筛选，只有整合ADE2基因标记的多克隆拷贝的转化子才能在缺乏腺嘌呤的培养基中生长，转化子的颜色与目的基因的表达量直接相关；

但是目前的毕赤酵母表达系统在发酵放大过程中面临诸多的问题：诱导外源重组蛋白表达时需使用甲醇作为碳源，甲醇有毒，不适于用于食品或者添加剂的生产，并且易燃易爆易挥发，在工业化生产中车间需进行防暴设计，导致成本增大；甲醇发酵强耗氧，一般靠增大空气的通气量和提高转速很难满足氧气的需求，因此需要通很多纯氧，给工业化生产带来不便，另外消耗的甲醇越多所产的热量也越大，所需设备的冷却能力要求越高；毕赤酵母AOX1启动子的高效转录离不开甲醇，在其它碳源中遭受碳源阻遏作用。

这些问题导致抗菌肽在毕赤酵母中的表达效果差，更重要的是利用甲醇诱导表达的抗菌肽产品中存留甲醇，甲醇毒性使这种抗菌肽产品无法在食品、饲料和医药领域中应用。因此，通过基因工程手段，开发一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能利用氯化胆碱诱导的改良石斑鱼抗菌肽PisL9K22WK的酵母表达载体及工程菌构建方法，抗菌肽发酵制备PisL9K22WK方法及应用，本发明的酵母菌及表达产物可以用于表达医药与食品级抗菌肽，安全环保，操作简单，适于大规模推广应用。

本发明采用的技术方案如下：

首先，构建改良石斑鱼抗菌肽PisL9K22WK的毕赤酵母胞内表达载体，包括如下步骤：

1)克隆毕赤酵母FLD1启动子基因；