[发明专利]一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法

权利要求书

1.一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，所述的方法是将抗菌肽PisL9K22WK工程菌单菌落接种于培养基中发酵培养，其特征在于，所述的方法还包括如下步骤：向接种后的培养基内添加诱导物氯化胆碱及碳源山梨醇，使培养基内的氯化胆碱的终浓度为1%-5% w/v, 使培养基内碳源山梨醇的终浓度为0.5%-5% w/v;

所述的诱导物氯化胆碱及碳源山梨醇于发酵液OD600的吸光度在2.0后的第24小时开始添加;

抗菌肽PisL9K22WK工程菌的构建步骤如下：（1）采用SpeI酶酶切表达载体FPLC，获得线性化载体；（2）通过电转化的方法将线性化载体转入粉红毕赤酵母中，电转化的参数为1000-2000V，3-6ms；（3）通过缺腺嘌呤的PAD培养基筛选粉红毕赤酵母转化子，经过3-7天培养后从转化子中进一步筛选出表达PisL9K22WK基因的工程菌;

所述的载体FPLC采用如下步骤构建而成：1）克隆毕赤酵母FLD1启动子基因：提取毕赤酵母全基因组，以全基因组为模板，以Seq ID NO .4和Seq ID NO .5为引物对FLD1启动子基因进行PCR扩增，获得SEQ ID No.1；2）克隆石斑鱼抗菌肽基因PisL9K22WK：将SEQ IDNo.1连接T载体，得到FLD-T，以FLD-T为模板，以Seq ID NO .4和Seq ID NO .6为引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物作为模板，以Seq ID NO .4和Seq ID NO .7为引物再次进行PCR扩增，获得FLDPIS如SEQ ID No.9所示；抗菌肽PisL9K22WK的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；3）将毕赤酵母表达载体pPINKLC 采用BglII和KpnI双酶切去除醇氧化酶启动子，与SEQID No.9采用BglII和KpnI双酶切后的片段连接，获得表达载体FPLC。

2.如权利要求1所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1）种子液的制备：挑取抗菌肽PisL9K22WK工程菌单菌落，接种于YPD 液体培养基中，28-30℃，200-250rmp，摇床培养 18-24h，获得发酵种子液；2）发酵培养：以 1%-5% v/v 接种量接种于发酵培养基中，24-28℃，200-250rmp，摇床培养24h-48h，待发酵种子液OD600的吸光度在2.0后的第24小时添加诱导物氯化胆碱和碳源山梨醇，添加氯化胆碱至终浓度为1%-5% w/v，添加碳源山梨醇至终浓度为0.5%-5% w/v。

3.如权利要求2所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，发酵培养基的组成为：1%-5% w/v酵母提取物，1%-10% w/v 蛋白胨，100-500 mM磷酸钾缓冲液，0.5%-5%w/v YNB，4×10^-5单位生物素，0.5%-5% w/v的山梨醇。

4.如权利要求3所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，发酵培养基的组成为： 1% w/v酵母提取物，2% w/v蛋白胨，100 mM磷酸钾缓冲液，所述的缓冲液pH为6.0，1.34% w/v YNB，4×10^-5单位生物素，1% w/v山梨醇。

5.如权利要求2所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，步骤2）发酵培养中温度为25℃，转速为250rpm。

6.如权利要求2所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，每隔24h添加一次碳源山梨醇和氯化胆碱，共添加4-6次。

7.如权利要求1所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，抗菌肽PisL9K22WK工程菌的构建步骤（2）中，电转化的参数为1500V，5ms。

8.如权利要求1所述的一种非甲醇诱导生产抗菌肽的方法，其特征在于，所述的粉红毕赤酵母为pichaPINK 1。