[发明专利]一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域。本发明试剂盒能够检测临床常见的16致病细菌：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、表皮葡萄球菌、洋葱克雷伯菌、噬麦芽食单胞菌的16S rRNA，具有特异性高、灵敏度高、污染低及准确、快速检测的特点，将在临床微生物的快速鉴定和检测分析中发挥重要作用，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及检测方法。适用于临床常见致病细菌的菌种鉴定，可以为临床细菌感染患者合理地进行抗菌药物治疗提供指导。

背景技术

细菌感染是临床常见的感染性疾病，其发病率和死亡率高，如果得不到早期的诊断和治疗，会严重危及患者的生命。从临床样本中直接分离得到细菌表示感染严重需要立即进行抗菌治疗。不同的致病菌对药物种类和浓度的敏感性不同，治疗成功的关键在于早期应用合适足量的药物。而传统的检测致病菌的方法如显微镜检查、培养法、生物化学检查和免疫学方法等，由于各种因素的影响，通常需要几种方法联合使用，而且耗时也较长，需要1～3d，这期间用药不当往往使得患者病情加重或增加菌株耐药性。特别是在多种细菌联合感染的情况下，更增加了菌种鉴定和用药的复杂性。因此，建立一种快速且特异性强的微生物检测方法是十分必要的。

PCR方法是近年来发展起来的诊断技术，这种技术快速、灵敏，在临床微生物检测方面获得了极为广泛的应用；但是PCR检测方法也存在一些不足，如检测每一种病原菌都需要特异性引物，因而每次反应只能确定一种病原菌的有无，这种“一对一”的模式不适合检测混合感染的复杂标本。临床微生物的检测急需建立一种“一对多”的检测系统，可以通过一次反应检测多种目标病原体。而通过恒温扩增-分子信标探针——一种新兴的高通量检测技术，使得通过一次反应对多种病原菌的同时检测成为可能。

转录介导的核酸扩增技术(Transcription mediated amplification，恒温扩增)是近年来发展起来的一种直接快速检测RNA的等温扩增技术，它克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA病毒的检测。与PCR不同，恒温扩增是在M-MLV、T7RNA聚合酶两种酶的共同协作下，在41～42℃，由一对引物指导的连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增酶促反应。其中一条引物其5’端具有被T7RNA聚合酶识别的启动子序列。在恒温扩增基础上结合分子信标(molecular beacon)探针建立的等温扩增技术，具有以下优点：⑴等温扩增：反应在同一恒温体系条件下进行；⑵快速高效、灵敏度高:该反应时一种无需升降温的连续快速扩增，也不需RT-PCR反应中第一阶段15～30分钟的反转录过程，整个反应时间短、单链RNA产物积累迅速，可以在30～60分钟内完成检测，一个反应可同时完成对多种临床常见致病细菌的快速鉴定；并使模板RNA扩增10⁹倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA。恒温扩增技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感10～1000倍，比常规PCR方法也敏感10～100倍；⑶特异性强：反应不需高温变性，即使有双链DNA污染也不会被扩增，而通过分子信标探针进行熔解曲线分析进一步提高了检测的特异性和灵敏度；⑷设计简单：只需设计1对引物和1条探针来识别靶RNA的3个不同区域。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用，以解决现有技术中临床常见致病细菌检测方法灵敏度较低，检测周期长、易污染出现假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种RNA恒温扩增熔解曲线法检测临床常见致病细菌的引物和分子信标探针，包括如下序列：

正向引物F1：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；