[发明专利]高信噪比多探针PCR Taqman探针及其应用

说明书

本发明公开了一种多探针PCR Taqman探针，其为标记有荧光基团和淬灭基团的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一碱基T，淬灭基团标记在所述碱基T上，荧光基团标记在淬灭基团的上游碱基上，并且与淬灭基团距离8～25nt。本发明通过改变并缩短荧光基团和淬灭基团的标记位置，并将淬灭基团标记在探针寡核苷酸序列的碱基T上，可显著增强淬灭基团对荧光基团的抑制效率，降低背景噪音；尤其是当本发明应用于多探针PCR时，可明显降低背景叠加噪音，扩大信号区间，提高信噪比和检测的灵敏度，从而提高了数据的重复性，可进一步促进多探针PCR技术的发展，提高检测效率，降低反应成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。更具体地说，本发明涉及一种高信噪比多探针PCRTaqman探针及其应用。

背景技术

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程的定量实验技术。多探针荧光定量PCR是在同一PCR反应体系含有针对多个特异的靶序列的多对探针进行PCR反应和荧光检测。

目前荧光定量PCR采用最多的探针为Taqman探针，该探针为一寡核苷酸，探针的5'端修饰一个报告荧光基团，3'端修饰一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5'端→3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

但是由于Taqman探针的长度一般在18～45nt之间，因此淬灭基团无法完全的吸收报告基团的荧光，所以在荧光定量PCR的过程中存在一定的背景噪音。而在多重荧光定量PCR过程中，一个通道中探针个数会增加到10个甚至更多，这样会导致背景噪音的叠加，从而降低了荧光信号的信噪比，导致多重荧光定量PCR在同一荧光通道探针较多的情况时出现灵敏度降低等检测困难的现象。

中国发明专利CN200710122376.X公开了一种荧光标记的寡核苷酸探针及其应用。该发明的探针一改传统Taqman探针中把荧光报告基团和荧光淬灭基团分别放在探针两端的设计方法，把荧光淬灭基团设计在探针的中部，同时在荧光淬灭基团两端各修饰一个荧光报告基团，该发明的探针一分子探针被水解时可以释放两分子荧光，可以增强荧光信号强度，提高检测的灵敏度，但是其成本也加倍，并且背景噪音没有减弱，甚至会更强，因此开发一种高信噪比的多重荧光定量PCR Taqman探针对于提高多重荧光定量PCR的灵敏度是十分必要的。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种多探针PCR Taqman探针，其能够有效降低Taqman探针PCR尤其是多Taqman探针PCR的背景噪音，提高检测的灵敏度。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种荧光定量PCR Taqman探针，其为标记有荧光基团和淬灭基团的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一碱基T，所述淬灭基团标记在所述碱基T上，以确保淬灭基团标记的稳定性，保证淬灭效果，所述荧光基团标记在淬灭基团的上游碱基上，并且与所述淬灭基团距离8～25nt(nt为单链核苷酸)，使淬灭基团可最大程度上吸收荧光基团发射的荧光，降低荧光定量PCR背景，但荧光基团与淬灭基团的标记的距离也不能过近，当荧光基团与淬灭基团之间的距离小于8nt时，探针上荧光基团与淬灭基团标记的位置越近，荧光基团被水解释放后发射的荧光信号强度越低，影响结果检测的灵敏度。

优选的是，其中，所述寡核苷酸序列的长度为18～45nt(nt为单链核苷酸)，既保证探针与模板结合效率，又保证淬灭基团的淬灭效果。