[发明专利]一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒的检测方法。

背景技术

传染性喉气管炎病毒（ILTV）是疱疹病毒科的一个成员。本病主要侵害家禽，可引起鸡传染性喉气管炎(AILT)是一种急性、接触性上部呼吸道传染病。其特征是呼吸困难、咳嗽和咳出含有血样的渗出物。剖检时可见喉部、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。病死率在20%以上。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展。目前尚无有效的治疗药物，主要依靠疫苗进行免疫预防。

目前，在流行病学监测和致病机理研究中，对传染性喉气管炎病毒基因诊断方法经常使用的是传统PCR方法，其特异性不强，易出现假阳性，操作繁琐，易产生PCR污染问题，只能对反应的终产物进行半定量或定性分析，且结果必须通过下一步的电泳进行条带分析得到。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，解决传统PCR方法特异性不强，易出现假阳性，操作繁琐，易产生PCR污染，只能对反应的终产物进行半定量或定性分析的问题，具有特异性强，灵敏度高，操作简单快速，不易出现假阳性，不易产生PCR污染，对PCR进程进行实时检测，对每一个循环进行定量和定性分析，分析结果可以直接通过计算机读出的特点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

（1）引物设计：针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR，上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；

（2）传统PCR扩增：首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增，通过预变性、变性、退火、延伸步骤，快速特异地在体外扩增出目的DNA片段；

（3）阳性标准品制作：将目的DNA片段连接入载体，转入感受态细胞，构建重组质粒作为阳性标准品；

（4）荧光定量PCR检测：用梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法；

（5）对该引物进行了特异性和灵敏度检测。

传统PCR检测结果显示，引物特异性良好，ILTV的DNA 有扩增条带，大小为116bp，阴性对照ddH₂O未检测到扩增条带；real-time PCR 检测结果同样表明引物特异性，该对引物对ILTV只有唯一的产物吸收峰。

进一步地，步骤（3）中所述阳性标准品制作的步骤为：将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接，转化于DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h，提取重组质粒，测序，用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，根据摩尔定律，计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度，依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释，作为标准品。

进一步地，步骤（4）中所述荧光定量PCR检测的步骤为：用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。

进一步地，步骤（1）中所述gB基因Gen Bank登录号为EU104985。

进一步地，步骤（2）中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为：2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH₂O 7μL。

进一步地，步骤（2）中所述反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5 min。

进一步地，步骤（3）中所述振荡培养的条件为37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h。