[发明专利]一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）引物设计：针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR，上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；

（2）传统PCR扩增：首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增，通过预变性、变性、退火、延伸步骤，快速特异地在体外扩增出目的DNA片段；

（3）阳性标准品制作：将目的DNA片段连接入载体，转入感受态细胞，构建重组质粒作为阳性标准品；

（4）荧光定量PCR检测：用梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法；

（5）对该引物进行了特异性和灵敏度检测。

2.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（3）中所述阳性标准品制作的步骤为：将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接，转化于DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h，提取重组质粒，测序，用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，根据摩尔定律，计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度，依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释，作为标准品。

3.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述荧光定量PCR检测的步骤为：用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。

4.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（1）中所述gB基因Gen Bank登录号为EU104985。

5.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（2）中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为：2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH₂O 7μL。

6.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（2）中所述反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5 min。

7.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述real-time PCR扩增的20μL的反应体系为：2×SYBR GreenⅠ qPCR Master Mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH₂O 7μL。

8.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述real-time PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min,95℃变性10s，60℃退火30s，40℃延伸30s，共40个循环；扩增反应结束后加热至95℃变性15s，降至60℃保温1min，以0.1℃/s递增加热至95℃。

9.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（5）中所述特异性检测方法为：对提取出的病毒DNA 分别进行传统PCR和real-time PCR扩增，以ddH₂O为阴性对照。

10.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（5）中所述灵敏度检测的方法为：将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和real-time PCR扩增。