[发明专利]一种快速简易的基因多态性检测方法及试剂盒和应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种快速简易的基因多态性检测方法及试剂盒和应用。本发明将样品与样品处理液混合处理后，无需进行DNA提取步骤，在很短时间内实现对样本的简易处理，并进一步通过选择性扩增引物与选择性检测探针实现对目标核酸序列野生型变异体与突变型变异体的有效区分，从样本处理到获取最终检测结果整个过程在1h内完成。本发明所述方法可用于基因多态性、碱基插入或缺失的检测，具有检测周期短，结果准确，特异性强的优势。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速简易的基因多态性检测方法及试剂盒和应用。

背景技术

多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。人类遗传基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。疾病基因多态性的研究不但可以揭示同一种疾病不同临床表型的实质，也是个体化治疗的基础。

目前用于检测基因多态性的方法很多，主要有选择性扩增方法与选择性检测方法两类，其中选择性检测方法主要以TaqManTM探针为代表，Taqman探针是一种经典的定量PCR技术，现阶段得到广泛应用，在PCR反应体系中加入一对引物和一个特异性荧光探针，探针只与两条引物之间特异性模板结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5’到3’的外切酶活性会将探针序列上5’端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，使得报告荧光发光。针对突变位点分别设计两个不同荧光标记突变探针、野生探针，根据突变探针、野生探针荧光信号强度进行SNP位点基因型判读。该方法的缺点在于：首先该方法不存在选择性扩增机制，不同基因型结果差异不明显，每次做qPCR检测必须设置三个基因型对照，很难在单个样品检测的情况下进行准确精确基因分型。此外，由于突变型所占比例十分稀少，易导致信号淹没在与待检测目的序列突变型变异体相似的野生型变异体所产生的信号中，其选择性没有选择性扩增法的选择性高。

因此，等位基因选择性扩增允许我们选择性的扩增并检测目的核酸序列的基因多态性。在一个成功的选择性扩增系统中，只有目的核酸序列中的突变型变异体被扩增，而目的核酸序列的野生型变异体不被扩增、或者目的核酸序列的野生型变异体的扩增效率远远低于目的核酸序列中突变型变异体的扩增效率。为了达到选择性扩增的目的，多种方法被开发出来，如下述的PCR夹子方法、RFLP-PCR方法、数字PCR方法、低变性温度下共扩增PCR方法、等位基因特异性PCR法(ARMS-PCR法)等。

1、PCR夹子方法(PCR clamping method)通过抑制目的核酸序列的野生型变异体的扩增来达到选择性扩增待检测目的片段的目的。使用肽核酸(PNA)或使用锁核酸(LNA)的方法分别在文献[Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)]和[Luoet al.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2 e12(2006)]中公开。但是，与目的核酸序列的野生型变异体与突变型变异体通常只有一个碱基与待检测目的片段不同，这种方法并不能完美的抑制住这些非目的片段的扩增。

2、RFLP分析法：基于基因突变导致的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再利用限制性内切酶进行酶切反应，电泳观察片段的大小，但绝大多数变异位点并不涉及酶切位点的改变，因此此方法不具备通用性，同样由于操作步骤多而难以进行高通量平行分析。