[发明专利]一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学和分子生物学技术领域中的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒。

背景技术

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，在细胞发育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理过程中发挥重要作用。研究发现，人的体液中如血液、尿液、唾液、羊水、胸腹水等广泛存在microRNA，这些microRNA的表达谱与在组织细胞中一样，在肿瘤等病理状态下会发生特征性的改变，这些特定的 microRNA表达谱是肿瘤细胞特异性生物标志物之一，是一种新的无创伤性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。传统的microRNA检测方法包括印迹杂交技术（Northern Blotting），以及反转录与实时定量PCR（realtime PCR）联合应用，这些方法比较成熟且广为使用，但是存在着过程繁琐、价格昂贵、耗时较长、灵敏度低、易出现假阳性结果等缺陷，日益无法满足当前的检测需要。

诸多研究显示，MicroRNA100在宫颈癌、口鳞状细胞癌、鼻咽癌、肺癌、甲状腺瘤、膀胱癌及肝癌等恶性肿瘤中低表达，通过抑制PLK1、RBSP3、MTOR等靶基因表达起到抑癌作用，而在另外一些恶性肿瘤如弥散型胃癌、儿童急性髓细胞性白血病、儿童急性淋巴白血病、神经胶质瘤及髓母细胞瘤中microRNA100高表达，通过调节ATM、ATD2、SMARCA5等靶基因表达发挥原癌基因作用。由于microRNA能够以少量游离的形式存在于外周血中，因此microRNA100可作为肿瘤标志物用于对某些恶性肿瘤的早期筛查。因此，研究开发一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒一直是急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，该发明用于对体外细胞培养、离体组织、血液等样本提取的总微小核糖核酸100（microRNA100）中的某一种微小核糖核酸100（microRNA100）的进行半定量检测，利用探针进行微小核糖核酸100（microRNA100）的半定量检测，无需反转录及任何扩增技术，只需将少量样本直接加入反应体系中，50-65 ℃恒温5-30分钟，检测荧光强度即可，荧光强度累积速率与微小核糖核酸100（microRNA100）浓度成正比。

本发明的目的是这样实现的：一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量检测，所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒包含的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针和一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液；

所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短，其中A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’ ROX-CTCGGCATACCTATAGATACAAGCTTGCCGAGT-(BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGT-3’， 序列中的ROX为荧光基团，BHQ2为淬灭基团；B链核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAC-3’；

所述的一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液，杂交温度在55-65 ℃之间，由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO₄ 10 mM、dNTP Mix 1 mM/种、Tris-HCl 20 mM、(NH₄)₂SO₄ 10 mM、KCl 50 mM组成，其中MgSO₄ 浓度在5-20 mM之间调整；

所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针的荧光基团与淬灭基团的修饰位置，荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上，淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上；

所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒用于对总RNA中的微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量检测是通过如下步骤来实现的：

（1） 取浓度为10 μM的探针1 μL，加入到12 μL含DNA链置换酶2μL的杂交缓冲液中，混匀；