[发明专利]一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒

权利要求书

1.一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量检测，其特征在于：所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒包含的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针和一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短，其中A链核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’ ROX-CTCGGCATACCTATAGATACAAGCTTGCCGAGT-(BHQ2)CTCCAGACGTCACTCAGT-3’， 序列中的ROX为荧光基团，BHQ2为淬灭基团；B链核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’GGTGCACTGAGTGACGTCTGGAGAC-3’。

3.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种含DNA链置换酶的杂交缓冲液，杂交温度在55-65 ℃之间，由Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase 32 U、MgSO₄ 10 mM、dNTP Mix 1 mM/种、Tris-HCl 20 mM、(NH₄)₂SO₄ 10 mM、KCl 50 mM组成，其中MgSO₄ 浓度在5-20 mM之间调整。

4.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种具有“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的探针的荧光基团与淬灭基团的修饰位置，荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上，淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上。

5.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒用于对总RNA中的微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量检测是通过如下步骤来实现的：

（1） 取浓度为10 μM的探针1 μL，加入到12 μL含DNA链置换酶2μL的杂交缓冲液中，混匀；

（2）向上述液体其中加入5 μL样本，混匀后送realtimePCR仪检测；

（3）检测条件通常为60 ℃恒温30分钟，检测温度及检测时间和可根据具体情况在50-65 ℃、5-30分钟之间调整；

（4）结果分析，荧光强度累积速率与样本中目的微小核糖核酸100（microRNA100）含量成正比，检测结果判定的方法有两种，当待测样本中目的微小核糖核酸（microRNA100）含量较低时，相同时间内荧光强度值越高的样本，其目的微小核糖核酸100（microRNA100）的含量越高；当待测样本中目的微小核糖核酸100（microRNA100）含量较高时，达到相同荧光强度值所用时间越短的样本，其微小核糖核酸100（microRNA100）的含量越高。

6.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒，其特征在于：所述的一种可直接对微小核糖核酸100（microRNA100）进行半定量的试剂盒利用这种空间结构的进行微小核糖核酸（microRNA100）的半定量检测的工作原理是，靶序列启动的自身信号循环放大反应”：初始结构的探针（无荧光信号）→靶序列的出现→与探针结合后引发探针变形（变形后发出荧光信号，非靶序列不引起探针变形）→链延伸→链置换（初始结构探针不会发生链延伸及链置换反应）→靶序列重新游离→再次引起其它初始形态的探针变形（自身信号循环放大）。