[发明专利]一组丙型流感病毒LAMP检测用引物及其应用

说明书

本申请属于丙型流感病毒检测技术领域，具体涉及利用环介导逆转录等温扩增技术(RT‑LAMP)检测丙型流感病毒时所用引物序列的专利申请。一组丙型流感病毒LAMP检测用引物，包括外引物对INF‑CF3/INF‑CB3、内引物对IFN‑C FIP/IFN‑C BIP两对引物，利用该引物组可制备RT‑LAMP检测用试剂盒。总体而言，基于现有环介导逆转录等温扩增技术原理，本发明首次将其应用于丙型流感病毒检测应用中，应用范围广泛，既可人用，也可兽用，具有操作流程一致度高，检测结果稳定可靠等优点，对于丙型流感病毒检测及预防体系的建立具有十分重要的应用价值。

技术领域

本申请属于丙型流感病毒检测技术领域，具体涉及利用环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测丙型流感病毒时所用引物序列的专利申请。

背景技术

RT-LAMP技术的原理是：设计两对引物（一对内引物、一对外引物），特异性识别靶序列中的六个结合区域，在具有置换活性的Bst DNA 聚合酶及逆转录酶AMV的催化下，使RNA模板在特定恒温环境中通过循环置换反应实现快速、特异、灵敏地扩增，从而达到检测病毒的目的。

RT-LAMP扩增主要分为两个阶段，第一阶段为哑铃状扩增始发物的形成：内引物FIP和BIP除了在3’端与模板互补外，其5’端还可与下游扩增产物中的部分序列互补，使得新合成的单链产物两端可形成一个类似哑铃状的环形结构。第二价段为循环扩增阶段：以第一阶段形成的哑铃状的环形DNA为模板，进行周而复始的扩增和延伸，扩增的终产物是具有不同长度、不同个数茎环结构的DNA混合物，其在电泳后的琼脂糖凝胶上可形成连续的梯状条带。

从RT-LAMP的原理和特点可以看出，与常规基因检测方法相比，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着很大的优势。第一，操作简单：与传统PCR方法相比，该反应是在恒温条件下进行的，除了使用一些常用聚合酶外，不需要特殊的仪器设备和娴熟的实验技能，只需要简单的恒温装置（如恒温水浴锅，恒温培养箱等）即可完成检测工作。第二，快速高效：RT-LAMP反应不需要经历普通PCR的变性、退火、复性等复杂过程，核酸扩增在30~60min内即可完成，且产物可达到10⁹~10¹⁰水平。另外该反应省略了单独的逆转录反应，在实验实施过程中，只需在同一反应管中添加逆转录酶，一步反应即可完成实验操作，减小了污染的机率。第三，特异性强：只有在四条引物完全与靶序列中的六个结合区完全匹配的情况下，扩增反应才能顺利进行，任何一条不匹配反应都无法进行，故具有极强的特异性。第四，灵敏度高：对于病毒核酸的扩增模板量可低至几个拷贝，且产物扩增迅速。第五，结果判定简便：利用普通的DNA电泳和紫外灯等简单设备即可判断是否有阳性反应。或者利用染色剂HNB的蓝或紫色的变换，通过肉眼即可直接观察到阴阳性反应。

丙型流感病毒（Influenza C virus）自1947年首次在美国分离得到以来，在日本、英国、希腊等多国相继发现，特别是日本某些地区一直在持续监测该病毒的流行情况。丙型流感病毒为正粘病毒科、丙型流感病毒属的唯一种，是一种单股负链RNA病毒，由7个RNA片段组成，分别为：PB2、PB1、P3、HE、NP、MP和NS，可编码9种蛋白质。与甲型和乙型流感病毒一样，丙型流感病毒也能够普遍感染人群，引起发热、流涕、咳嗽等感冒症状。

国外流行病学及血清学研究表明，丙型流感病毒对人的感染通常发生在儿童期，从1岁起血清阳性百分率会随着年龄逐渐增加，在20~30岁左右达到最高水平。我国郭元吉教授曾于 1981 年和 1982 年在猪群中分离到 2 株丙型流感病毒，破除了最初人们认为人是丙型流感病毒的唯一自然宿主的说法。但到目前为止没有关于丙型流感病毒在中国人群中流行情况和感染状况的监测数据。