[发明专利]阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程领域，涉及一种生产阿卡波糖的工程菌以及该菌的制备方法和应用。所述阿卡波糖工程菌是产阿卡波糖的游动放线菌或其衍生菌株，其中以下一个或两个基因失活：(i)编码序列如SEQ ID NO:2所示或与SEQ ID NO:2所示序列有至少80％、90％、95％或99％序列同一性的多肽的基因M；(ii)编码序列如SEQ ID NO:3所示或与SEQ ID NO:3所示序列有至少80％、90％、95％或99％序列同一性的多肽的基因N。利用本发明的阿卡波糖工程菌生产阿卡波糖，产品中杂质A组分和/或B组分的含量显著降低，保证了产品质量，不需后续提纯步骤或提纯步骤相对简单，减少工艺步骤，降低了成本。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种生产阿卡波糖的工程菌以及该菌的制备方法和应用。

背景技术

据统计，目前我国糖尿病患者人数已达1.1亿人，中国已成为世界糖尿病人最多的国家。此外，中国还有约1.5亿人为糖尿病前期。单单用于糖尿病管理，现在中国每年就要投入近1734亿人民币；而用于糖尿病的直接医疗支出已经占到中国医疗支出的13％。。

游动放线菌(Actinoplanes sp.)产生的降糖药阿卡波糖是II型糖尿病的首选治疗药物，国内年销售额已近20亿元。目前阿卡波糖在生产上主要存在杂质组分问题，严重影响产品质量；其中最为突出的是杂质A、B和C组分(各组分结构见图1所示)。一般情况下，产品中对A、B组分含量的要求均在0.5wt％以下(相对于阿卡波糖含量)，杂质含量不达标的产品不能进入销售渠道。然而现有的由游动放线菌发酵工程生产的阿卡波糖中，A和B组分含量一般分别在10wt％和3wt％以上，即使较为优秀的菌种，其A和B组分含量也在1wt％以上。为保证产品质量，需要进行后续提纯步骤，导致工艺复杂，生产成本提高。

目前使用较多的是通过控制发酵过程来控制杂质组分的含量，但是该方法不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的阿卡波糖工程菌，其生产的产品中杂质A组分和B组分含量降低；同时还提供该菌的生产方式和应用等，以解决现有技术的上述问题。

在第一个方面，本发明提供一种阿卡波糖工程菌，所述阿卡波糖工程菌是产阿卡波糖的游动放线菌(Actinoplanes sp.)或其衍生菌株，其中以下一个或两个基因失活：

(i)编码序列如SEQ ID NO:2所示或与SEQ ID NO:2所示序列有至少80％、90％、95％或99％序列同一性的多肽的基因M；

(ii)编码序列如SEQ ID NO:3所示或与SEQ ID NO:3所示序列有至少80％、90％、95％或99％序列同一性的多肽的基因N。

在本发明中，“至少X％序列同一性”是指要比较的两个多肽的氨基酸序列之间的百分比相同性，其是在所述两个氨基酸序列的最佳排列对比后获得的。所述最佳排列对比可以通过使用本领域已知的任何方法获得，例如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源排列算法，Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性搜索方法及这些算法的计算机执行程序，如由NCBI站点上可用的BLAST P计算机软件所使用的那些。