[发明专利]一种CYP2C19基因*2、*3、*17位点多态性检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于CYP2C19基因*2、*3、*17位点的多态性检测试剂盒。

背景技术

心脑血管血栓性疾病是一种常见的疾病。中国心肌梗死平均发病率约为每10 万人中有42 人, 而且随着营养状况的改善, 发病率呈增长趋势。中国也是脑血栓病人高发地区, 目前患病人数已超过1000万, 每年新发病例约150 万人, 每年死亡者达100 多万。在存活者中, 约25 %的人不同程度地丧失劳动能力, 其中重度致残高达40 %以上。更为重要的是, 近年来以冠状血栓和脑血栓为主的血栓栓塞性疾病的发病率呈上升趋势, 严重危害人类的健康。因此, 对这类疾病的防治研究十分重要。血小板聚集是正常凝血机制中的一个关键环节, 血小板的黏附、聚集、释放反应导致血栓形成。因此, 抑制血小板聚集药物在治疗血栓病中发挥重要作用, 抗血小板药一直是人们研究的热点。研制和开发新型抗血小板药物不仅可以保障人类健康、降低社会医疗成本, 而且可以产生良好的经济效益。

目前, 应用比较广泛的血小板抑制剂有阿司匹林(aspirin , ASA , 乙酰水杨酸)、噻氯匹定(ticlopidine)和氯吡格雷(clopidogrel)。氯吡格雷是作用于血小板受体的抑制剂，其经肝脏代谢后，转化为活性产物，通过阻断二磷酸腺苷（ADP）受体抑制血小板的聚集，从而阻止病理性血栓的形成。氯吡格雷在临床上被广泛应用于急性冠状动脉综合症。氯吡格雷与噻氯匹定同属噻吩并吡啶衍生物, 作用机制与噻氯匹定类似, 但作用强度和耐受性均高于噻氯匹定。氯吡格雷在副作用方面比噻氯匹定更为有利, 和阿司匹林的总体耐受性相似。临床上应用于治疗动脉粥状硬化疾病、急性冠状动脉综合征、预防冠状动脉内支架植入术后支架内再狭窄和血栓性并发症等。

然而，临床研究发现，在服用常规剂量的氯吡格雷患者中，有 4% ～ 30% 在 24 小时内达不到预期的抗血小板作用这类患者在服用常规剂量的氯吡格雷后仍有很高的血小板反应性，容易发生心血管事件。有专家把该现象称为氯吡格雷无反应、氯吡格雷低反应、或统称之为氯吡格雷抵抗。

发生氯吡格雷抵抗的可能机制主要有外在和内在两方面因素：外在因素包括患者的生活习惯（如吸烟/ 饮酒）、用药依从性及药物 — 药物相互作用等；内在因素主要是个体遗传差异。氯吡格雷需经肠道 P- 糖蛋白转运体转运后吸收入血，在肝脏经细胞色素 P450 酶代谢转化生成为有活性的产物。其活性代谢产物选择性地、且不可逆地与血小板表面受体 P2Y12 结合，从而发挥抗血小板活性的作用。因此，转运体、药物代谢酶和受体的基因多态性均可能与氯吡格雷抵抗有关。其中，药物代谢酶的基因多态性是影响氯吡格雷疗效的主要因素，也是近年来国内外研究最多的因素。因此，临床急需一种通过检测CYP2C19基因型而评估CYP2C19酶代谢活性，并判定服用氯吡格雷后是否有效的试剂盒。

本试剂盒基于多重PCR-LDR技术，具有高度特异性和灵敏性，适用于定性检测CYP2C19基因*2、*3、*17位点基因突变，检测结果仅供临床医生或相关研究人员参考及辅助指导用药，不能单独作为治疗依据。。

发明内容

本发明的目的在于：为了克服现有技术检测灵敏度和特异性方面的不足以及检测通量底的问题，现提供一种检测CYP2C19基因*2、*3、*17位点的多态性检测试剂盒。

本发明的技术方案为：提供种检测CYP2C19基因*2、*3、*17位点的多态性检测试剂盒，采用PCR-LDR技术对CYP2C19基因*2、*3、*17位点进行定性检测。在使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法纯化试剂（核酸提取及纯化试剂（产品型号：体液DNA））对全血样本进行核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，防止产物污染。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰、可靠性高。

本发明提供的试剂盒包括：PCR缓冲液，DNA聚合酶，LDR缓冲液，DNA连接酶，阳性对照，阴性对照。

本发明提供的试剂盒中引物探针经过特异性设计和筛选获得，引物探针详细核苷酸序列如下：

用于扩增CYP2C19基因*17位点的上游引物序列为：

5’- GCAGTGATGGAGAAGG -3’（ SEQ ID No.1）；

用于扩增CYP2C19基因*17位点的下游引物序列为：

5’- TCAAATGGGAAAAGGG -3’（ SEQ ID No.2）；

用于扩增CYP2C19基因*3位点的上游引物序列为：