[发明专利]精准可控双相色谱微柱及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及色谱微柱，尤其是涉及可以实现同一根色谱微柱中精准可控地填充两种固定相材料，用于复杂生物样品在线二维分离的精准可控双相色谱微柱及其制备方法。

背景技术

液相色谱是目前最为常用的用于实际生物样品分析的分离技术。近年来，随着高效液相色谱仪器的不断进步以及色谱填料技术的不断改进，液相色谱的分辨率有了很大的提升，然而即便是使用高效的色谱柱在非常缓的梯度下运行，液相色谱的峰容量都将达到一个理论峰容量在1400～1600之间的极限，对于高度复杂的生物样品来说单一分离模式的液相色谱的峰容量仍显不足。

多维分离是通过耦合不同模式的单维分离技术以构建更高分辨率的分离系统，理论上多维分离的峰容量为每一维峰容量的乘积，因此多维分离是进一步提高峰容量的有效方法。构建理想多维分离平台有两个标准，第一个标准是维与维之间必须是正交的，即每一个分离维度都是基于不同的分离机制对样品进行分离。在多维分离系统中，耦合正交的单维分离技术是获得高峰容量的一个先决条件。第二个标准是在后一个维度的分离中不能损失前一维已经获得的分辨率，即对第一维的样品不能采样过疏，样品在转移至下一维的过程中也不能出现区带展宽或返混的现象。

构建二维液相色谱分离平台最为直接的方法是将两种不同分离机理的色谱柱直接相连，传统的方法是将两根含有不同填料的色谱柱用连接管或者二通进行连接，将样品捕集在第一根柱子的柱头后使用台阶梯度以此洗脱，每一个洗脱的组分经第二根色谱柱分离后进入光学检测器或进行质谱检测。近些年还出现了一种多维蛋白鉴定技术(MudPIT)用于大规模蛋白质组学分析，即在同一根空毛细管中先后填充反相C18填料和强阳离子交换填料，这种含有两种固定相材料的双相色谱柱省去了柱间的连接管，减少了操作的繁琐性，同时降低了柱外峰展宽对于分离效率的影响。该多维蛋白鉴定技术对啤酒酵母全蛋白组进行分析鉴定出1484种蛋白质，充分展现了其在高通量蛋白组分析中的应用潜质。但传统的双相色谱柱由于无法将两种填料物理性地区隔开，无法分别精确控制两种填料柱床的长度，使得分离重现性难以保障。因此，研制一种精准可控的双相色谱微柱是这一技术领域的关键问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一目的在于提供可精确控制两种固定相柱床长度，有效解决分离重现性的问题，方法操作简单，使用方便，利于推广的精准可控双相色谱微柱。

本发明的第二目的在于提供精准可控双相色谱微柱的制备方法。

所述精准可控双相色谱微柱设有一根毛细管，毛细管内分别填充有两种色谱固定相，两种色谱固定相之间设有一个多孔微球作为填料定位点进行区隔，毛细管两端分别设有柱塞，所述柱塞为多孔微球。

所述毛细管可采用中空石英毛细管，所述毛细管的内径可为25～500μm。

所述作为填料定位点的多孔微球和作为柱塞的多孔微球均可采用二氧化硅多孔微球。

所述精准可控双相色谱微柱的制备方法，包括以下步骤：

1)截取所需长度的毛细管，根据所需两种固定相柱床长度在毛细管外标出填料定位点，将一颗多孔微球压入毛细管一端，然后将微球推至填料定位点；

2)将所要填充的色谱左固定相加入溶剂中，超声震荡制成匀浆，通过外力驱动使得匀浆通过毛细管，溶剂被填料定位点处的多孔微球滤过，填料本身则在毛细管中逐步堆砌成柱床；在填充完成后，毛细管一端压入一个同上述一致的多孔微球作为柱塞；

3)将所要填充的第二种右固定相加入溶剂中，超声震荡制成匀浆，通过外力驱动从毛细管另一端进入毛细管中，待填充完成后，压入同样的多孔微球作为柱塞，从而完成整根两相色谱微柱的制备。

在步骤1)中，所述多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述毛细管可采用中空石英弹性毛细管，毛细管的内径可为25～500μm；所述在毛细管外标出填料定位点可用记号笔在毛细管外标出填料定位点；所述将微球推至填料定位点可使用外径小于毛细管内径的石英丝将微球推至填料定位点。

在步骤2)中，所述左固定相可选自反相C18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料等中的一种。

在步骤3)中，所述右固定相可选自反相C18填料、阴离子交换填料、阳离子交换填料、亲水作用填料等中的一种。

在步骤2)和3)中，所述作为柱塞的多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述溶剂可采用密度和黏度较大的有机溶剂，所述有机溶剂可选自二氧六环、环己烷、四氯化碳等中的一种；所述外力驱动可采用液流驱动或气流驱动；所述左固定相和右固定相可为同种色谱填料或不同种色谱填料。