[发明专利]一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒。以铅离子特异性识别的脱氧核酶为分子识别元件，设计茎环结构核酸，结合核酸外切酶III的选择性切割作用，实现检测信号的循环放大。以G‑四聚体为信号报告分子，实现免标记分析。本发明具有较高的灵敏度，对铅离子的检测限为10 pM，检测具有很好的特异性，常见干扰物对检测不产生影响。检测过程无需检测仪器，结果直接肉眼可见，具有操作简单，成本低廉，响应迅速等优点，可用于环境或食品样品中铅离子含量的快速检测。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒。

背景技术

铅离子（Pb²⁺）是一种有神经毒性的重金属元素，对人体危害严重，可对神经系统、血液系统、消化系统和肾脏等造成危害。美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量不得超过72 nM。

目前，常规的铅离子检测方法主要有原子吸收光谱，电感耦合等离子体质谱法，原子荧光光谱等方法。这些方法需要分离富集，操作繁琐费时或需配置大型仪器，不利于快速现场检测。近年来，利用对Pb²⁺敏感的脱氧核酶（17DS-17E DNAzyme）为分子识别元件检测Pb²⁺的方法备受关注（D. Mazumdar, J. Liu, G.Lu, J. Zhou and Y. Lu, Chem.Commun., 2010, 46, 1416-1418），已建立荧光、电化学以及胶体金比色法等分析技术，但大多需要进行标记， 或需要使用检测仪器获得数据，因而限制了这些技术的广泛应用。因此，迫切需要建立一种新型检测技术用于铅离子的检测，使检测过程无需使用检测仪器，检测结果直接肉眼可见，并使检测体系无需标记，从而节约成本。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明旨在利用铅离子特异性识别的脱氧核酶为识别元件，结合工具酶介导的信号扩增，以G-四聚体为信号报告分子，建立一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种免标记铅离子可视化检测试剂盒，包括DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系，氯高铁血红素，还包括下列成分：核酸序列17DS、17E、H1以及核酸外切酶III。

具体分析如下：

底物链核酸序列17DS：碱基数为40-48个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列（铅离子（Pb²⁺）特异性识别的脱氧核酶）；其中rA为切割位点，rA-G左右两旁的5个碱基与17E互补；17DS的3'端有至少6个碱基不与17E互补，在17E的3'端有至少6个碱基不与17DS互补（防止17DS-17E被核酸外切酶III切掉）；当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近17DS的5'端部分记名为A区，用于启动下一步反应；如果没有铅离子存在，那么催化链和底物链还是继续互补结合在一起。

催化链核酸序列17E：碱基数为36-42个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列（铅离子（Pb²⁺）特异性识别的脱氧核酶），其中TCCGAGCCGGTCGAAA构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的5个碱基与17DS互补；17E的3'端至少有6个碱基不与17DS互补；其反应原理见上说明。