[发明专利]一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种免标记铅离子可视化检测试剂盒，包括DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系，氯高铁血红素，其特征在于，还包括下列成分：

底物链核酸序列17DS：碱基数为40-48个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列；其中rA为切割位点，rA-G左右两旁的5个碱基与17E互补；17DS的3'端有至少6个碱基不与17E互补；当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近17DS的5'端部分记名为A区，用于启动下一步反应；

催化链核酸序列17E：碱基数为36-42个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列，其中TCCGAGCCGGTCGAAA构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的5个碱基与17DS互补；17E的3'端至少有6个碱基不与17DS互补；

核酸序列H1；从3'端开始依次为B区域、C区域和D区域，其中C区和部分D区互补，构成茎环结构的茎部分，B凸起于茎结构外；H1的B与17DS切割后的A区的5'端互补，A的3'端凸起；D区为富含G碱基的核酸序列，加入氯高铁血红素后，会形成具有催化活性的G四聚体结构；

以及核酸外切酶III。

2.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的D区域的核酸序列包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。

3.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的D区域的核酸序列为GGGTAGGGCGGGTTGGG。

4.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的C区碱基数为5-10个。

5.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的C区碱基数为7个。

6.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，20mM，pH为7.4，含有200mM NaCl以及50mM KCl。

7.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。

8.据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：底物链核酸序列17DS，催化链核酸序列17E，核酸序列H1，其序列如下所示：

17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTCACTAT-rA-G-GAAGAGATGAAAAAA-3'；

17E:5'-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTGAGTAAAAAA-3'；

H1:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTACCC-AGTGCTAGGTAGATGTCG-3'。

9.一种免标记铅离子可视化检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)先用DNA杂交缓冲液分别溶解17DS、17E以及H1，将等量的17DS与17E混合，室温反应30分钟，形成17DS-17E混合物；

2)将待测溶液加入到17DS-17E混合物中，室温反应45分钟，完成切割反应；

3)加入H1和核酸外切酶III，室温反应90分钟；

4)加入适量氯高铁血红素，室温反应30分钟，取出50μL反应液，加入到950μL显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；当有铅离子时，溶液显色，当没有铅离子时，溶液无色；其中，17DS、17E、H1以及DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系如权利要求1～8任意一项所示。