[发明专利]基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法

说明书

本发明公开了基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；2)将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；3)通过开关切换，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为纳秒脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；4)继续通过开关切换，将纳秒脉冲电压切换为微秒脉冲电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，已处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞。

技术领域

本发明涉及细胞融合的方法，具体是一种基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法。

背景技术

细胞融合能够实现远源杂交，其意义在于打破了仅仅依赖有限杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方式无法获得的新型的杂交动物或植物细胞，扩大了遗传物质的重组范围。

细胞融合是生物制备的基本途径。细胞能否有效融合是决定生物制备是否可行的关键，甚至成为制约生物制备技术发展的瓶颈。因此，如何发展和改进现有的细胞融合方法、提升细胞融合的效果和效率，已成为国内外生物制备领域的一个研究热点。

根据电融合的基本原理，细胞膜上出现足够数量和尺寸的孔洞(即细胞电穿孔)，是细胞融合的先决条件。而细胞要发生电穿孔，细胞的跨膜电压必须大于其细胞膜穿孔所需的电压阈值。传统的微秒脉冲在细胞融合时存在一定的缺陷，电穿孔的理论研究表明，在微秒脉冲作用下，细胞跨膜电压值与细胞半径呈显著正相关。因此，微秒脉冲对细胞膜的电穿孔效应与细胞尺寸有直接关系，当融合不同尺寸的细胞时，作用相同场强的脉冲，半径较大的细胞会先发生穿孔，半径小的细胞后发生穿孔，换言之，当小细胞发生穿孔的时候，大细胞可能已经处于过度穿孔的死亡状态。现有技术中，当两种细胞的半径相差1.5～5倍时，细胞难以融合或融合率极低。

纳秒脉冲电场以其独特的“细胞内电处理”效应在生物医学领域得到越来越多的关注。所谓“细胞内电处理”效应，是指在外加纳秒脉冲(脉冲宽度为ns级，电场强度为MV/m级)的作用下，细胞出现一种与前述微秒脉冲电穿孔现象截然不同的生物学效应：细胞膜表面不会出现明显的电穿孔现象(即膜表面保持完整)，但细胞内部(如细胞核、线粒体等)却出现一系列功能性改变，产生大量微核，同时诱导细胞发生程序性死亡(也称之为“凋亡”)。

事实上，纳秒脉冲在透过细胞外膜作用于胞内细胞器并诱导“细胞内电处理”效应的同时，也能作用在细胞外膜上并在其上产生大量纳米级尺寸的微孔。仿真和实验证明，纳秒脉冲对细胞膜的电穿孔效应与细胞尺寸没有关系，纳秒脉冲能够用于不同尺寸细胞的融合。但是纳秒脉冲应用于细胞融合时存在一定的缺陷，纳秒脉冲电压作用于细胞后，虽然会在细胞膜表面产生穿孔，但是穿孔的孔径很小，并且持续的时间很短，很可能导致细胞还未融合，细胞膜上的穿孔就已经复原。

因此，单纯利用纳秒或者微秒脉冲进行细胞融合都具有一定的缺陷，如果能结合利用纳秒脉冲与微秒脉冲的优势，采取复合脉冲电场的形式作用于细胞融合，对于细胞电融合领域具有十分重要的意义。

发明内容

目前国际上广泛使用的将微秒脉冲作用细胞融合。本发明的目的是解决微秒脉冲作用不同尺寸细胞融合时，存在难融合和效率低的问题。微秒脉冲对细胞膜的电穿孔效应与细胞尺寸有直接关系，当小细胞发生穿孔的时候，大细胞可能已经处于过度穿孔的死亡状态，针对这种缺陷,提出一种基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法。

具体是将纳秒脉冲引入细胞电融合，使细胞膜先在纳秒脉冲的作用下产生微小的“孔洞”，然后再将微秒脉冲作用细胞，使“孔洞”进一步增大，从而一定程度上提高电融合的成功率。本方法不仅可以用于相同尺寸的细胞电融合，而且可以用于融合不同尺寸的细胞。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；