[发明专利]基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法

权利要求书

1.基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；

2)将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；

3)通过开关切换，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为纳秒脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；

4)继续通过开关切换，将纳秒脉冲电压切换为微秒脉冲电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，已处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞。

2.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤1)中不同尺寸的细胞包括大细胞或小细胞，所述大细胞的半径范围为:5～15μm，所述大细胞的半径是小细胞半径的2～7倍；

所述大细胞的密度为2×10⁷～5×10⁷个/L，所述小细胞的密度是大细胞密度的五倍；

所述步骤1)中的细胞为植物细胞或动物细胞；如选择的细胞为植物细胞，融合前需对植物细胞进行去壁处理再进行融合。

3.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤1)中的融合液包括体积比为(1～3):(1～3):(2～4)的PM缓冲液、酶液和CPW盐溶液；

所述PM缓冲液由MgCl₂、CaCl₂、山梨醇和三蒸水配制而成；所述MgCl₂的浓度为0.05～0.4mmol/L，CaCl₂的浓度为0.05～0.5mmol/L，山梨醇的浓度为200～500mmol；

所述酶液由Cellulase OnzukaR-10、Mecerozyme R-10和甘露醇配制而成；所述Cellulase OnzukaR-10的浓度为0.5％～3％，Mecerozyme R-10的浓度为0.5％～2％，甘露醇的浓度为10％～30％；

所述CPW盐溶液：KH₂P0₄、KN0₃、CaCl₂·2H₂0、MgS0₄·7H₂0、KI和CuS0₄·5H₂0配制而成；所述KH₂P0₄的浓度为15～30mg/L，KN0₃的浓度为80.0～110.0mg/L，CaCl₂·2H₂0的浓度为1200.0～1600.0mg/L，MgS0₄·7H₂0的浓度为210.0～260.0mg/L，KI的浓度为O.1～O.5mg/L，CuS0₄·5H₂0的浓度为0.025～0.1mg/L。

4.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤2)中正弦交流电压参数范围：小于或等于100V，频率小于或等于1MHz,持续时间：小于或等于100s。

5.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤3)中的纳秒脉冲是通过电容充放电实现的。

6.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤3)中纳秒脉冲参数：小于或等于5000V，场强小于或等于15kV/cm，作用个数1～1000个，脉冲间隔0.1S～10S，波形为脉冲方波，脉冲宽度50ns～500ns。

7.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤4)中的微秒脉冲参数：小于或等于3000V，场强小于或等于9kV/cm，作用个数1～1000个，脉冲间隔0.1S～10S，波形为脉冲方波，脉冲宽度15μs～400μs。

8.根据权利要求1所述的基于复合脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于：所述步骤4)中得到的融合细胞除不同尺寸细胞融合而成外，还能够是相同尺寸细胞融合而成。