[发明专利]胎盘细胞外基质的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及胎盘细胞外基质的制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

组织与器官的功能丧失是人类健康的主要障碍。理论上，组织与器官的再生可以克服这些障碍。

有机体内固有的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)可以引导器官发育、修复和生理再生。

目前，细胞外基质去细胞的方法主要有三种：

(一)血管灌流法；

(二)酶学法；

(三)化学脱细胞剂清洗法。

这些去细胞的方法常常有下述的缺点：

(一)脱细胞时间长；

(二)组织去细胞化不完整；

(三)异体组织抗原残留；

(四)细胞外基质生物成分和物理性能受到损害。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种胎盘细胞外基质的制备方法，该制备方法不仅简单易操作，而且脱细胞时间短，同时获得的外基质去细胞化完整、无异体组织抗原残留、生物成分和物理性能不会受到损害。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种胎盘细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：将新鲜胎盘速冻并保存在-80℃环境中，冻存48h以上；

Step2：将冻存的胎盘取出，室温融化；

Step3：将融化的胎盘组织分离，并在研磨机上研磨成组织碎块，大小为0.1mm～2mm；

Step4：对研磨得到的组织碎块进行去细胞、病毒灭活和漂洗处理；

Step5：将处理后的组织碎块预先放置在-20℃～-80℃环境中过夜，或者迅速浸在干冰中，然后将组织碎块放置于冻干机内冻干24h～48h，即得胎盘细胞外基质。

前述的制备方法，其特征在于，在Step4中，前述去细胞、病毒灭活和漂洗处理在室温下进行，具体的过程如下：

(1)将组织碎块浸于浓度为0.2％～2％的SDS溶液中，持续搅拌混匀30min～60min；

(2)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为0.3％～3％的Triton X-100溶液中，持续搅拌混匀1h～24h；

(3)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为1％～5％的NaCl溶液中，持续搅拌混匀30min～60min；

(4)将经上述处理后的组织碎块浸于浓度为0.2％～2％的过氧乙酸溶液中，持续搅拌混匀15min～30min；

(5)将经上述处理后的组织碎块浸于去离子水中，持续搅拌混匀30min～60min；

(6)重复步骤(1)至步骤(5)，重复两次。

前述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，前述SDS溶液的浓度为1％。

前述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，前述Triton X-100溶液的浓度为2％。

前述的制备方法，其特征在于，组织碎块浸于浓度为2％的Triton X-100溶液中后，持续搅拌混匀4h。

前述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，前述NaCl溶液的浓度为3％。

前述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，前述过氧乙酸溶液的浓度为1％。

本发明的有益之处在于：

(1)本发明的制备方法结合了三种组织器官脱细胞方法，简单易操作，脱细胞时间大大缩短，生物成分和物理性能不会受到明显损害，最大程度保留了各种细胞反应因子和伤口愈合因子，富含胶原蛋白、弹力纤维蛋白和GAGs，有益于生产扩大化；

(2)本发明的制备方法因为将组织预先加工成碎块，所以去细胞化完整，无异体组织抗原残留。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

第一部分：制备胎盘细胞外基质

Step1：冻存

将新鲜胎盘速冻并保存在-80℃环境中，冻存48h以上，保证彻底冰冻。新鲜胎盘取自于人体。

Step2：融化

将冻存的胎盘取出，室温融化。

Step3：研磨

将融化的胎盘组织分离，并在研磨机上研磨成组织碎块，组织碎块的大小为0.1mm～2mm。

Step4：去细胞、病毒灭活和漂洗

对研磨得到的组织碎块进行去细胞、病毒灭活和漂洗处理，在室温下进行，具体的过程如下：