[发明专利]多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的方法

权利要求书

1.用于多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的引物组合，其特征在于，包括：

用于扩增保藏编号为CGMCC No.3052的Pannonibacter phragmitetus BB菌的Cr(VI)还原功能基因HcrR及其核蛋白体核糖核酸16s亚基基因16s rDNA-BB的引物，用于扩增保藏编号为ATCC No.700550的Shewanella oneidensis MR-1菌的Cr(VI)还原酶基因OmcA及其核蛋白体核糖核酸16s亚基基因16s rDNA-MR-1的引物，用于扩增保藏编号为ATCCNo.700007的Pseudomonas putida F1菌的Cr(VI)还原酶基因ChrR及其核蛋白体核糖核酸16s亚基基因16s rDNA-F1的引物；

引物序列如下：

HcrR-F：5'-GGGACAACTACACCGCAGAC-3'

HcrR-R：5'-AGCCAGAGCGATGCCGAA-3'

OmcA-F：5'-ATTGGCTATGGCGGTAAGGTA-3'

OmcA-R：5'-AACAGATCGGCATTAGCAGGT-3'

ChrR-F：5'-CAAGCTCAATGACAAGACG-3'

ChrR-R：5'-GCCCTGTTCAACTTCACCCAT-3'

16s rDNA-BB-F：5'-TTCACAACACGAGCTGACGA-3'

16s rDNA-BB-R：5'-CAACGCGAAGAACCTTACCT-3'

16s rDNA-MR-1-F：5'-ACGTGCTACAATGGCGAGTA-3'

16s rDNA-MR-1-R：5'-TTCATGGAGTCGAGTTGCAG-3'

16s rDNA-F1-F：5'-CGCGTGTGTGAAGAAGGTCT-3'

16s rDNA-F1-R：5'-CACAGAGTTAGCCGGTGCTT-3'。

2.含有权利要求1所述引物组合的用于多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的试剂盒。

3.多重实时荧光PCR检测Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因的方法，其特征在于，基于多重实时荧光PCR检测技术，利用权利要求1 所述引物组合或权利要求2所述试剂盒对Cr(VI)还原复合菌群六种功能基因进行多重实时荧光PCR检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包含两个PCR反应体系，其中一个体系用于检测Pannonibacter phragmitetus BB菌的Cr(VI)还原功能基因HcrR、Shewanellaoneidensis MR-1菌的Cr(VI)还原酶基因OmcA及Pseudomonas putida F1菌的Cr(VI)还原酶基因ChrR，另一个体系用于检测上述三种菌的核蛋白体核糖核酸16s亚基基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品的总RNA，反转录成cDNA；

2)以上述cDNA为模板，分两管进行实时荧光定量PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)其中一个管的PCR扩增体系为：2×FastStart Essential DNA Green Master 25μL，HcrR、OmcA、ChrR各基因上下游引物的终浓度分别为0.05μM、0.2μM、0.2μM，cDNA模板1μL，RNase/DNase Free dH₂O至总体积50μL；

另一个管的PCR扩增体系为：2×FastStart Essential DNA Green Master 25μL，16srDNA-BB、16s rDNA-MR-1、16s rDNA-F1各基因上下游引物的终浓度分别为0.2μM、0.1μM、0.2μM，cDNA模板1μL，RNase/DNase Free dH₂O至总体积50μL。