[发明专利]乳酸乳球菌食品级双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体的工程菌株、其构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种乳酸球菌食品级双筛选标记分泌表达载体及其制备方法，该载体包括melA基因和含有P32启动子的nisI融合基因双选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用的P32启动子和乳酸球菌Usp45分泌蛋白的部分序列。本发明还公开了NN1‑1作为外源蛋白表达载体的一种应用，包括以NN1‑1为载体构建的分泌表达产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)的内切葡聚糖酶(end‑l)基因的重组乳酸乳球菌。

【技术领域】

本发明属于生物工程与技术领域，涉及到一种可以在乳酸乳球菌中分泌表达的外源基因的双筛选标记分泌表达载体、含有所述载体的工程菌株、其构建方法及应用。

【背景技术】

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌[De VosW M.Gene expression systems for lactic acid bacteria.CurrentOpinionin Microbiology,1999,2(3):289～295]，是公认的安全食品级微生物，具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态系统平衡、抑癌和增强免疫力等重要生物学功能，在食品、饲料、制药等领域的应用越来越广泛[ELMADFA I,KLEIN P,MEYER A L.Immune-stimulatingeffects oflactic acid bacteria in vivo and in vitro[J].Proc Nutr Soc,2010,June 16:1-5.[Epub ahead of print].]。乳酸菌能够作为异源蛋白表达的宿主菌，有以下几点原因：①不产生内毒素或其他毒性物质[Bolotin,A.,Wincher,P.,Mauger,S.,Jaillon,O.,Malarme,K.,Weissenbach,J.,Ehrlich,S.D.,Sorokin,A.,2001.Thecompletegenome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcuslactisssp.lactis IL1403.Genome Res.11,731–753]；②乳酸菌可以粘附并存活在肠道中,其用于降解、治疗、免疫作用的外源基因表达产物可以持续地在肠道中产生,成为生物体内功能性生物制剂的合成及处理中心,从而起到相应的提供营养、保护和治疗性作用；可在细胞内、表面甚至分泌到细胞外表达。但是由于乳酸菌表达载体很少，尤其是具有高筛选、多用途、表达高的分泌型载体更少，限制了乳酸菌生物工程的发展[SUN Zhilan,KONGJian,KONG Wentao.Characterization of a cryptic plasmid p D403fromLactobacillus plantarum and construction of shuttle vectors based on itsreplicon[J].Mol Biotechnol,2010,45(1):24-33.]。