[发明专利]一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法，属于生物工程领域。本发明是以敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达β‑酮硫解酶基因、3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因、3‑羟基己二酰脱氢酶基因、5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因、己二酰辅酶A，己二酸的产量可达到25.57g/L。此重组菌还可进行循环发酵，最终经过十次循环，己二酸产量累积量达18.94g/L；这对于工业上连续化的大生产有着重要作用，可以减少菌体生长时间，直接利用循环菌体发酵省时，快速，节约成本。

技术领域

本发明涉及一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法，属于生物工程领域。

背景技术

己二酸(Adipic acid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。

目前己二酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在己二酸的化学合成过程中主要以苯为原料，通过化学方法合成，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的N₂O等温室气体，环境污染严重且不可持续。

为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。主要的生物催化法主要是利用微生物催化合成己二酸前体顺，顺-粘康酸，然后再利用金属催化剂催化合成己二酸。全生物合成己二酸的方法包括：大肠杆菌以葡萄糖为底物利用乙酰CoA和琥珀酰CoA作为底物全生物合成；酿酒酵母利用脂肪酸氧化法全生物合成己二酸。以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。虽然目前在大肠杆菌中已经实现了利用葡萄糖全生物合成己二酸，但是该途径需要10步以上的酶促反应，途径冗长且存在可逆反应，最终己二酸的产量极低(低于1mg/L)，经优化目前已报道的己二酸的最高产量为2.5g/L。

发明内容

本发明首先提供了一种产己二酸的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21(DE3)或敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)，3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)，己二酰辅酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1为表达载体；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a为表达载体；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体。

本发明还提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)以质粒pRSFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399，得到重组质粒pAD-1；

(2)以质粒pTrc99a为骨架载体，连接基因片段Tfu_0068、Tfu_1648，得到重组质粒pAD-4；

(3)以质粒pCDFDuet-1为骨架载体，连接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒pAD-6；

(4)将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Mad2ΔatoB。