[发明专利]一种提高大肠杆菌中己二酸产量的方法

权利要求书

1.一种产己二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，是以敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因Tfu_0875，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因Tfu_2399，3-羟基己二酰脱氢酶基因Tfu_0068、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因Tfu_1648，己二酰辅酶A合成酶Tfu_2576、Tfu_2577；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1为表达载体；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a为表达载体；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体；

所述重组大肠杆菌的构建方法包括以下步骤：

(1)将基因片段Tfu_0875及质粒pRSFDuet-1都用EcoR I和Hind III双酶酶切处理后，以T₄ DNA连接酶连接得到重组质粒pRSF-Tfu_0875；将Tfu_2399及重组质粒pRSF-Tfu_0875都用Bgl II和Kpn I双酶切处理，再用T₄ DNA连接酶连接，得到连接了基因片段Tfu_0875、Tfu_2399的重组质粒即pAD-1；

(2)将基因片段Tfu_0068、Tfu_1648通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pTrc99a上，得到重组质粒pAD-4；

(3)将基因片段Tfu_2576、Tfu_2577通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pCDFDuet-1上，得到重组质粒pAD-6；

(4)将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Mad2△atoB。

2.一种应用权利要求1所述重组大肠杆菌发酵生产己二酸的方法，其特征在于，是以SOB培养基为发酵培养基，将重组大肠杆菌于35～37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加1mM IPTG并降温至30℃诱导培养，当发酵培养基中的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L；所述SOB培养基成分为：2％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，0.05％NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，8g/L葡萄糖，5 0μg/mL硫酸卡那霉素，50μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL链霉素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以2％的接种量，将重组大肠杆菌Mad2△atoB接种至装有3L SOB培养基的5L发酵罐中，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加1mM IPTG，降温至30℃诱导；待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵到一定时间，将发酵体系中的重组大肠杆菌菌体分离收集起来，转接到新鲜发酵培养基中，如此循环往复。