[发明专利]一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷型人14型腺病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

腺病毒(Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度为34-38kb。目前报道的腺病毒有69个基因型，可分为A-G七个亚群。腺病毒不仅会引起无症状的感染，而且会诱发呼吸道疾病、眼部疾病和胃肠炎等。B亚群的3、7型和E亚群的4型腺病毒常诱发严重的呼吸道疾病。14型腺病毒自1955年从荷兰军队中被首次发现，长达半个世纪的时间里，并没有引起严重的呼吸道疾病和大范围的流行；然而，自2006年美国军队报道14型腺病毒出现后，14型腺病毒在美国频繁的引起感染和死亡。随后，在欧洲的爱尔兰地区和北美的加拿大都出现的14型腺病毒引起的感染和死亡。2011年，我国甘肃一所中学中也爆发了14型腺病毒的感染。针对14型腺病毒的流行和高致病性，目前尚无用于预防、治疗14型腺病毒感染的疫苗和药物；因此，研发抗14型腺病毒的疫苗和药物对人类健康具有重大意义。

自20世纪70年代，美军中就开始使用肠衣包被的4型和7型腺病毒活疫苗，起到了很好的保护效果。由于4型和7型腺病毒疫苗起到了很好的预防效果，1996年停止了腺病毒疫苗的生产，到了1999年，库存中的腺病毒疫苗使用殆尽，美军中再次爆发了腺病毒感染引起的呼吸道疾病，不得不重新启动4型和7型腺病毒疫苗的生产；由于目前的腺病毒疫苗只有美军中使用的4型和7型腺病毒活疫苗，对于最近爆发的14型腺病毒无确切的预防效果；另一方面，该疫苗主要成分为野生型腺病毒，残余活病毒从肠道排出后极易污染水源，造成病毒的扩散，因其安全隐患而不能应用于普通人群。因此，研制安全有效的复制缺陷型14型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。

复制缺陷型的腺病毒载体被广泛用于疫苗研发和基因治疗，不仅安全性高，而且可以在体内诱发强的免疫反应；腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因则可以对抗宿主的免疫系统，E1和E3基因同时敲除后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，具有减毒表型，而其主要的表面抗原如Hexon、Fibre等则不受影响。复制缺陷型的腺病毒疫苗不仅安全性高，而且可以在体内诱发针对腺病毒的免疫反应。复制缺陷型腺病毒可在互补细胞株，如表达Ad5 E1基因的293细胞、PerC6细胞中生产。但是，B亚群腺病毒敲除E1和E3基因后在这些生产细胞株中难以获得有效产量，主要原因是Ad5 E1B 55K不能与B亚型腺病毒E4 Orf6相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA的出核并提升病毒晚期蛋白的表达。

有研究报道，Ad26和Ad35的E4 ORF6替换为Ad5的E4 ORF6，同时敲除E1基因，仍可在293和PerC6细胞中复制并获得有效产量。目前尚无方法大量获得复制缺陷型的Ad14。E4基因包含了Orf1、Orf2、Orf 3、Orf 4、34K(Orf6)、Orf6/7等读码框，其编码的蛋白均可能与E1基因编码蛋白相互作用，在腺病毒复制与包装过程中起重要作用。

利用腺病毒载体进行的基因治疗已被大规模进行临床试验，目前，全球以腺病毒载体进行的临床试验比例已达22.2％，居各类载体之首。腺病毒载体的使用主要集中在Ad2和Ad5，由于人自然感染腺病毒，大多数人体中存在抗Ad2和Ad5抗体，限制了传统的腺病毒载体的使用。非洲、南美及我国等发展中国家和地区的人群中Ad2和Ad5中和抗体很高，阳性率甚至高达90％，中和抗体的存在限制了腺病毒进入机体细胞，使其无法行使免疫或者治疗功能。为了逃避体内预存抗腺病毒抗体的免疫反应，研究者尝试了一系列的策略：1)修饰或者改造腺病毒表面的衣壳蛋白，使其可以逃逸预存的免疫反应；2)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应；3)开发无预存抗体反应的黑猩猩腺病毒CV-68，63等稀有腺病毒载体4)我们此前开发的以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术；等等。Ad14尚未在人群中大规模流行，人体内缺少针对Ad14的中和抗体，因此基于人14型腺病毒的载体是Ad2、Ad5等载体的良好的替代品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述问题，提供一种复制缺陷型人14型腺病毒载体。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以解决：

一种复制缺陷型人14型腺病毒载体，由如下方法制备得到：将Ad14基因组质粒化，敲除Ad14的E1、E3基因，再将Ad14基因组中的E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。