[发明专利]一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1-T185N及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1‑T185N及其编码基因与应用，一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过利用PCR技术对全长褐藻胶裂解酶Aly‑1的N端截掉185个氨基酸残基，获得了T185N截短酶；rT185N的表达量可达1259±2.2mg/L发酵液，比酶活可达2895±10.3U/mg，比全长蛋白rAly‑1的表达量调高了近2.6倍，实现了增产、节能、提高经济效益的目的，并且rT185N可通过镍柱分离实现该融合蛋白的一步纯化。

技术领域

本发明涉及一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1-T185N及其编码基因与应用，属于基因工程技术和蛋白质表达技术领域。

背景技术

褐藻胶是由甘露糖醛酸(Mannuronate,M)及其C-5差像异构体古罗糖醛酸(Guluronate,G)通过糖苷键链接而成线性酸性多糖，分子内存在均一的聚M段、聚G段，以及杂合的MG或GM段。褐藻胶广泛存在于海带、马尾藻等药、食两用大型海洋褐藻的细胞壁和细胞间基质中。目前，日用化工、食品和医药领域应用的主体是海藻来源的褐藻胶。糖生物学的深入研究发现，褐藻胶寡糖具有重要生物学活性。例如，褐藻胶寡糖具有动态调节抗炎/促炎与抗氧化/促氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性等重要功能。聚M段褐藻胶寡糖具有成为抗阿尔兹海默综合症药物的潜力。综上，具有特定M/G比例和聚合度的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻胶裂解酶通过β-消去机制催化糖苷键的断裂，产生非还原性末端含不饱和共轭结构且在235nm附近具有特征吸收的系列寡糖产物。与化学或物理学降解方法相比，褐藻胶的酶法降解具有条件温和、易控制、环境污染小等优势特征，因而具有推广应用的潜质。通常内切酶可随机、高效降解多糖，生成聚合度不同的系列不饱和寡糖；外切酶可有序降解底物，专一性生成基本糖单元，供生物体吸收利用。由于褐藻胶是由M、G两种糖单元组成的，因此根据酶对底物的选择性以及酶的底物降解模式，通常可将褐藻胶裂解酶分为M-专一性内切酶、M-专一性外切酶、G-专一性内切酶、G-专一性外切酶、以及M/G-兼性内切酶、M/G-兼性外切酶等六大类。

褐藻胶裂解酶主要来源于海螺的消化系统、海藻降解菌或病毒等。目前，关于褐藻胶裂解酶的专利申请和科研文献虽然数量较多，但主要集中于产酶菌株和酶的资源发掘等初级研究；酶的专一性分析多以纯度有限的聚M段、聚G段为测试底物，而关于酶的寡糖产物的结构特征分析缺少寡糖终产物的核磁共振波谱数据，关于寡糖生成特性即相应底物降解机制(如最小底物、最小产物、最小产物在底物中的生成位置以及酶的底物倾向性等)的阐释相对较少；分子酶学研究以基因克隆与异源表达、重组酶的纯化与功能鉴定为主，关于活性位点突变、功能模块截短等分子改造的研究较少。关于分子酶学改造与褐藻胶降解模式之间关系的规律性认知更少。综上，褐藻胶裂解酶的传统研究基础薄弱、深度不足，这导致与β-琼胶酶、纤维素酶等同类产品相比，少见商品化褐藻胶裂解酶的广泛应用，严重制约了寡糖酶法制备技术的发展。

通常，褐藻胶裂解酶由一个催化模块结构域和一个或多个非催化区组成。催化结构域决定酶对褐藻胶底物的识别、结合与降解，从而决定该酶的生化特性；非催化区虽然不能降解褐藻胶，但对酶的催化性能可产生多方面的影响。最近，关于内切型褐藻胶裂解酶Aly2(来自Agarivorans sp.strain L11，兼性)和Aly5(也即AlgL-5，来自Flammeovirgasp.strain MY04，G专一性，专利文献CN104293754A，申请号201410469861.4)的研究表明，非催化区的存在可以帮助催化结构域更加有效地结合、降解小分子量的寡糖底物。然而差别在于，截短兼性的Aly2后，可有效地相对提高酶对聚M片段底物的倾向；但对G专一性的Aly5进行同样截短操作后，未见这种底物倾向性的显著变化。那么，为什么非催化区只能对这种兼性的褐藻胶裂解酶产生底物倾向性的影响，而对专一性的褐藻胶裂解酶基本没有影响？对于兼性的褐藻胶裂解酶，非催化区域又是如何影响催化区域进而改变底物倾向性的呢？目前，仅见相关实验现象的报道，未见详细机制的探讨。