[发明专利]H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种利用实时荧光PCR检测H10N7禽流感病毒的试剂盒，其特征在于包括：

(1)RNA提取试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；

(2)引物组和探针组；引物组有引物1至引物4，分别对应序列表SEQ.ID.No.1和2、SEQ.ID.No.4和5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，分别对应序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述RNA提取试剂采用病毒RNA提取试剂盒；

所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括PCR扩增缓冲液、引物1、引物2、引物3、引物4、探针A、探针B、逆转录酶、DNA聚合酶、RNase抑制剂；

所述阳性对照品采用H10N7阳性对照，阴性对照品采用DEPC H₂O。

3.一种非诊断目的的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于包括如下检测步骤：

S1、标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取；

S2、RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用磁珠法进行核酸提取；

S3、RT-PCR扩增反应：

RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探针混合液，逆转录酶，DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水,RT-PCR质控品,标本RNA核酸；其中，所述的特异性引物和探针是针对HA和NA基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计,能够区别其他病毒株；

所述的特异性引物为：

H10-F：5’-AGTGAAATAGAACACCAAATTGGCA-3’SEQ ID No.01；

H10-R：5’-TGCTACCAGCAATTCAGCCT-3’SEQ ID No.02；

N7-F：5’-AGAGTGAGGAAGCAACTAAGGC-3’SEQ ID No.O4；

N7-R：5’-AGAAGAGAGTCTCACCGGACT-3’SEQ ID No.O5；

所述的特异性探针为：

H10-P：5’-FAM-ACTAAGGATTCCATAACAG-3’SEQ ID No.O3；

N7-P：5’-VIC-ATACCACAAATGTGACGACA-3’SEQ ID No.O6；

将上述混合好的反应液进行PCR扩增及荧光信号检测；

S4、结果判定：对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若RT-PCR反应产物的荧光检测结果呈阳性，则待测样品含有H10N7禽流感病毒。

4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤S2中所述的RNA提取采用病毒RNA提取试剂盒提取，取140ul标本，按照试剂盒说明书中的操作步骤提取RNA，最后用60ul洗脱液洗脱RNA。

5.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤S3中所述的RT-PCR反应体系为：RT-PCR反应液10.0μl,引物探针混合液2.75μl，逆转录酶0.2μl，DNA聚合酶0.2μl，RNase抑制剂0.4μl，DEPC H₂O 6.45μl,标本核酸5.0μl。

6.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤S3中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min；95℃变性2min；95℃变性5s，60℃退火和延伸60s，40个循环。

7.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的H10N7禽流感病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述探针H10-P的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；所述探针N7-P的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。