[发明专利]一种检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于病毒检测的引物和试剂盒，特别是涉及用于检测鲑鱼甲病毒的特异性的荧光定量PCR引物，本发明还涉及利用该引物和Eva Green荧光染料进行鲑鱼甲病毒检测的方法和试剂盒。本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)，主要感染大西洋鲑(salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和褐鳟(Salmo trutta L.)等鲑科鱼类引起胰脏病、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，并在水产养殖的各个阶段均有爆发。1995年Nelson等在爱尔兰首次从患胰脏病的大西洋鲑和虹鳟体内分离出该病毒，1997年Castric等又在法国从患昏睡病的大西洋鲑和虹鳟体内分离到SAV，目前该病广泛流行于英格兰、苏格兰、挪威、法国、波兰、意大利和西班牙等欧洲国家，据统计从1995年至2007年发病率逐年增加高达90％，每年由此疫病造成巨大的经济损失。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。虽然，我国目前尚未有文献报道检测到该病毒，但是，随着近年我国对鲑科鱼类进口和鲑科鱼类卵引进的增加，该病传入我国的风险也日益增大。因此，我国建立SAV快速诊断和测检方法是紧迫的任务。

目前已发现六个基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5、SAV 6)。其中，SAV 1、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6可感染大西洋鲑引起胰腺病(Salmon pancreas disease，PD)；SAV 2可感染虹鳟引起睡病(Sleeping disease，SD)。SAV病毒粒子具有囊膜，大小为65nm。单股正链RNA病毒，基因组长11-12kb，且含有两个开放阅读框(ORF)。基因组的第二个ORF编码26S子基因的mRNA，最终产生5个结构蛋白，即衣壳蛋白、E3、E2、6K、和E1共同构成了病毒的囊膜糖蛋白。E2在未成熟时，与E3相连，组成E2的前体，E3的作用相当于E2的信号肽。当E2成熟时，E2与E3分离，E2被转运到病毒粒子表面。

近年来，我国一些地方，特别是北方地区，大规模发展了冷水鱼类(如：虹鳟)养殖，且取得了巨大的经济效益。虽然我国目前尚未发现该病毒，但是随着近年我国对鲑科鱼类进口的增加，该病传入我国的风险也日益增大，因此有必要尽早建立对鲑鱼甲病毒快速灵敏的检测方法，防止该病传入我国，SAV的有效预报或者诊断是我们必须解决的问题。

核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为鲑鱼甲病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够简便、快速、灵敏、特异和高效地检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR方法。该方法检测覆盖鲑鱼甲病毒六个基因型，是一种特异性强，准确性高、灵敏性高的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明对已知鲑鱼甲病毒基因序列进行比对，筛选出鲑鱼甲病毒六个基因型的保守区序列，即E2蛋白基因中的一段保守序列(9471-9668bp)。针对该序列本发明发明人经反复筛选和验证，得到一对用于检测鲑鱼甲病毒六个不同基因型的荧光定量PCR引物，扩增片段大小为197bp(SEQ ID NO.1所示)，所述引物的序列如下：

上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQ ID NO.3)

进一步的，本发明还提出了一种用于检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，含有用于检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR引物对以及Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液，其中所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液包括dNTPs、Mg²⁺、Eva Green、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液为Golden HS EVA Green qPCR Mix。