[发明专利]一种检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有用于检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR引物对以及Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液，其中所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液包括dNTPs、Mg²⁺、Eva Green、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。

3.根据权利要求2所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液为Golden HS EVA Green qPCR Mix。

4.根据权利要求1-3任一项所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照为含有鲑鱼甲病毒E2基因的重组质粒标准品，所述的阴性对照为去离子水。

5.如权利要求1-4任一项所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，用于检测鲑鱼甲病毒时，包括以下步骤：

(1)将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80℃，备用；

(3)以步骤(2)得到的总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；

(4)PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。

6.如权利要求5所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，PCR扩增反应体系为：5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye0.4μl，浓度为0.3μM的上游引物及下游引物各0.5μl，模板1μl，最后用灭菌的去离子水补至20μl。

7.如权利要求6所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应程序为：(1)95℃预变性15min；(2)95℃变性10s、60℃退火30s，共40个循环。

8.如权利要求5所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值≤40.0时样品结果为阳性；Ct值＞40.0的样品结果为阴性。

9.权利要求2-8任一项所述的Eva Green荧光定量PCR试剂盒在制备检测鲑鱼甲病毒的试剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的鲑鱼甲病毒包括以下六个基因型：SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5以及SAV 6。