[发明专利]重组载体及其构建方法、人Pdx1基因表达调节剂筛选细胞及筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及重组载体及其构建方法、人Pdx1基因表达调节剂筛选细胞及筛选方法。

背景技术

糖尿病是一种常见、有遗传倾向、以高血糖为特征的慢性代谢性和全身进行性疾病，具有普遍性、高发病率和高死亡率的特点，现已成为继癌症、心脑血管疾病之后，人类第三大杀手。糖尿病防治在相当长的时期内将是人类面临的严峻挑战。寻找和开发新型、高效、安全治疗糖尿病的药物刻不容缓，是糖尿病治疗领域的首要任务。

糖尿病主要分为I型、II型，其中以II型糖尿病为主，占患糖尿病人数的90％以上。胰岛β细胞功能缺陷是形成II型糖尿病的主要原因之一，II型糖尿病也被称为是由于β细胞功能缺陷而导致的单基因或多基因遗传病(。胰岛β细胞功能缺陷的原因主要有胰岛β细胞块的减损和胰岛β细胞分泌功能的衰减。且研究表明，机体长期处于高糖环境中会诱发多种慢性炎症，出现胰岛β细胞数目减少，胰岛素分泌不足。因此，保护胰岛β细胞，调控胰岛素合成和分泌是治疗糖尿病的一种重要手段。

胰十二指肠同源盒1(pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx1)最早又被称为生长抑素活化因子-1(STF-1)、胰岛素启动因子-1(IPF-1)或胰岛素敏感因子(GSF)。其蛋白序列和结构域在不同物种间高度保守，且蛋白结构的氨基末端(N-terminus)是转录激活区，为胰岛素基因转录所必须，无论是在β细胞还是在非β细胞，都能活化胰岛素启动子。同时，Pdx1还能够调节β细胞的生长和增殖，抑制β细胞发生凋亡。Pdx1对β细胞生长和增殖的调控主要是通过Irs1/Irs2-PI3K-Akt信号通路实现的，Akt能直接调节其下游靶基因Pdx1的功能。最初，Pdx1与其它同源基因一起，在动物模型中被证实与凋亡之间有一定联系，渐渐许多研究也证实Pdx1表达降低与β细胞凋亡或因此而导致的细胞死亡密切相关，尤其当细胞处于高糖环境时，胰岛组织中Pdx1表达明显减少。Pdx1因而作为促进胰腺发育，调控胰岛素的合成和分泌、胰岛细胞分化的关键转录因子，在治疗糖尿病领域引起极大关注。

通过对Pdx1与II型糖尿病形成关系的研究，发现在II型糖尿病小鼠模型中，高血糖环境下，胰岛β细胞内Pdx1的表达降低，直接影响了胰岛素基因的表达和胰岛素的合成，同时影响了β细胞的增殖，使β细胞数目减少。在人类中发现，Pdx1基因的无义突变与II型糖尿病的形成密切相关，Pdx1基因缺失突变的患者亦表现出严重的糖尿病症状。诸多证据显示在患糖尿病的各个阶段都会发生β细胞功能缺陷，且起主导作用。而Pdx1的活性缺失则是β细胞功能缺陷的根本原因，这使得有正常功能的β细胞数目减少，导致胰岛素分泌不足，进而形成糖尿病。因此，Pdx1在维持β细胞的正常功能和调节糖代谢平衡方面起关键作用，是糖尿病治疗的一个潜在基因靶标，全面了解其与糖尿病发生的关系，进行必要的体外逆转实验，筛选出高效、低毒、低剂量的Pdx1表达激活剂，是一种治疗糖尿病的新方法。

基因的表达是受启动子控制的，在启动子上有很多元件供转录因子识别。某些转录因子与相应的元件结合后，将抑制下游基因的表达；而某些转录因子与相应的元件结合后，将激活下游基因的表达。不同的药物可能会通过不同的途径，直接或间接地影响不同的转录因子，使其与启动子上的相应元件结合后，表现出对下游基因表达的激活或抑制。

发明内容

本发明的发明目的之一是提供一组含有原始载体以及人Pdx1基因启动子的重组载体。

本发明的发明目的之二是提供构建上述重组载体的方法。

本发明的发明目的之三是提供包含上述重组载体的细胞株，进行人Pdx1基因表达调节剂筛选。

本发明的发明目的之四是提供一种对人Pdx1基因表达调节剂活性的筛选方法。

本发明提供的技术方案为：

含有外源多核苷酸的重组载体，包括原始载体以及人Pdx1基因启动子；

其中，所述人Pdx1基因启动子为包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列组成的DNA片段；以及

所述原始载体为质粒，其包含一个报告基因且不含启动子，所述人Pdx1基因启动子连接到所述报告基因的上游。

优选的是，所述报告基因为荧光素酶基因或者荧光蛋白基因。

优选的是，所述质粒为pGL3质粒或pEGFP1质粒。

构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，包括：