[发明专利]重组载体及其构建方法、人Pdx1基因表达调节剂筛选细胞及筛选方法

权利要求书

1.含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于，包括原始载体以及人Pdx1基因启动子；

其中，所述人Pdx1基因启动子为包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列组成的DNA片段；以及

所述原始载体为质粒，其包含一个报告基因且不含启动子，所述人Pdx1基因启动子连接到所述报告基因的上游。

2.如权利要求1所述的含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶基因或者荧光蛋白基因。

3.如权利要求1所述的含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于，所述质粒为pGL3质粒或pEGFP1质粒。

4.构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，其特征在于，包括：

步骤一、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列通过PCR扩增得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA片段，即为人Pdx1基因启动子；

步骤二、将所述步骤一中的人Pdx1基因启动子与TA克隆载体连接并进行扩增提取得到重组质粒，并使所述重组质粒具有XhoⅠ和HindⅢ酶切位点或者XhoⅠ和EcoRI酶切位点；

步骤三、将酶切后的重组质粒构建到原始载体上以得到重组载体；

其中，所述原始载体为质粒，其包含一个报告基因且不含启动子，所述人Pdx1基因启动子连接到所述报告基因的上游。

5.如权利要求4所述的构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，其特征在于，所述报告基因为荧光素酶基因或者荧光蛋白基因；

所述质粒为pGL3质粒或pEGFP1质粒。

6.人Pdx1基因表达调节剂筛选细胞，其特征在于，包括如权利要求1-3所述的重组载体；以及

所述筛选细胞包括HEK293T细胞或者HepG2细胞。

7.使用如权利要求6所述的筛选细胞筛选人Pdx1基因表达调节剂的方法，其特征在于，包括：

将所述筛选细胞接种于孔板中培养，加入待筛选化合物继续培养，进行荧光素酶检测，然后用待测样品处理组的荧光素酶活性值除以未用待测样品处理组重组质粒转染孔荧光素酶活性值，进而判断所述筛选细胞内报告基因表达强度的变化；

当所述筛选细胞内报告基因表达强度升高，所述待筛选化合物促进人Pdx1的表达；

当所述筛选细胞内报告基因表达强度降低，所述待筛选化合物抑制人Pdx1的表达。

8.如权利要求7所述的筛选人Pdx1基因表达调节剂的方法，其特征在于，所述筛选细胞的转染方法包括如下步骤：

步骤a、取HEK293T细胞，进行传代培养细胞至60％-80％，在2个无菌的离心管中加入无血清培养基，在其中一管加入转染试剂Lipo2000，另一管加入含有pGL3-Pdx1的质粒，将两管合并到一管，室温静置，然后将离心管中的液体逐滴加入到细胞中，混匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，弃去旧培养基后换上新鲜培养基；

步骤b、所述筛选细胞转染后，弃去旧培养基，加入细胞裂解液；向白色酶标板待测孔中加入Assay cocktail后，再加入细胞裂解液上清，酶标板待测孔中加入荧光素液，然后用荧光化学发光仪测定荧光素酶活性。