[发明专利]一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒及其应用，尤其涉及一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

猪支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)，又称猪地方流行性肺炎(swine enzootic pneumonia)，俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的猪的一种慢性呼吸道传染病。主要临诊症状为咳嗽和气喘，病理变化特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和隔叶前缘呈肉样或虾肉羊实变。本病广泛分布于世界各地，主要特点是高接触性、高传染性、高发病率和低死亡率为主要特点。临床主要表现为咳嗽，气喘，呼吸困难，日增重减少，长期生长不良，饲料报酬率大幅下降。该病常与其他呼吸道病原如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌或胸膜肺炎放线杆菌等病原协同引起猪地方性肺炎，常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒和猪圆环病毒2型的协同感染引起猪呼吸道综合征。MPS发病率一般在50％-80％，个别新建猪场发病率可达100％，死亡率高达14％-37％。流行后期或老疫区则以哺乳仔猪和断奶小猪多发，死亡率较高，母猪和成年猪多呈慢性和隐性感染。病猪与健康猪群混合饲养，常引起猪支原体肺炎的爆发。本病目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防制措施及对症疗法。最根本的办法是消除患病动物和彻底消毒，切断传播途径。因此应加强检疫和本病监测，以防本病扩散。支原体可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。病猪和带毒猪是主要传染源，无临诊症状有病理变化猪，或无临诊症状无病理变化阴性带菌猪较多常见。MPS的诊断方法主要有细菌分离和鉴定，ELISA方法检测抗体和PCR。PCR方法敏感性和特异性较好，是临床病原学诊断中较为普遍的一种方法。但是从细菌分离培养到纯化及DNA提取至少需要3-4天才能做出初步鉴定，不仅费时费力，结果也不准确，而且敏感性差，容易产生假阳性的结果，不利于养殖户和规模化企业采取相应的血清型疫苗和药物来进行及时的治疗。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出的一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒及其应用，检测迅速，灵敏性佳。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒，包含以下试剂：裂解液5μl，PCR扩增试剂20μl，阳性对照和阴性对照。

上述试剂的所述裂解液含有2～4M异硫氰酸酯、7～10M乙二胺四乙酸、15～20M十二烷基肌氨酸和3～6％体积比的聚乙烯基吡咯烷酮；所述PCR扩增试剂含有5×PCR Buffer、2.0M dNTP、10pM正向引物、10pM反向引物、高保真Taq酶5U/μl、20mM MgCl₂和纯净水。所述正向引物为MPSF：GAAGCTATCAAAAAAGGGGAAACTA，所述反向引物为MPSR：TGTATCGGTTTCAGAAGAAG。

本发明提供的试剂盒能快速、准确的检测出猪支原体肺炎病原支原体。可对猪支原体肺炎感染的单个样品检测，也可对临床病例中混合感染的检测，可用于猪支原体肺炎病原普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。

本发明进一步提供一种直接PCR检测猪支原体肺炎病原的试剂盒的应用，包括以下步骤：

第一步、样品的采集，分为病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集为无菌条件下采集病料0.1mg～100mg，装入无RNA酶污染的离心管中备用，所述鼻咽拭子采集为采集鼻咽液，装入无RNA酶污染的离心管中备用；

第二步、样品裂解，取液体状样品10μl～100μl或研磨后的固体状样品0.1mg～100mg，加400～600μl裂解液，震荡混匀；

第三步、直接PCR反应，反应体系为25μl，取裂解后的样品5μl，加入PCR扩增试剂20μl，充分混合均匀后短暂离心，PCR扩增程序为95℃3min；然后35个循环：94℃1min，55℃1min，72℃1min S；最后72℃10min；

第四步、PCR产物的检测，取5μl扩增产物和2μl Loading Buffer混匀，加到含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，同时加入对照和DNAMarker(DL 2000),电压为120V，电泳30min，然后在凝胶成像仪中观察结果。